摘要
全氟辛烷磺酸基化合物(PFOS)是全氟类化合物的重要成员，由于特殊的疏水和疏油性，其作为表面防污处理剂和表面活性剂等被广泛应用于工业生产和日常生活用品。由于PFOS独特的化学结构使其难以被环境降解和生物代谢，所以PFOS对生态环境污染和人类健康的影响已受到世界各国广泛关注。动物实验研究发现，PFOS主要富集在动物肝脏内，导致肝脏肿大、小叶中心肝细胞肥大、空泡化、脂代谢紊乱和过氧化物酶体增殖等副作用。但是，目前对PFOS导致肝毒性作用机制尚不明确。本论文主要研究PFOS诱导的氧化应激对肝脏氧化损伤、自噬凋亡和脂质代谢紊乱的作用及分子机制。研究结果如下: 1.miR-155调节核转录因子Nrf2通路对PFOS诱导肝细胞氧化损伤的影响。SD大鼠经连续灌胃1和10 mg/kg/day PFOS28天后，大鼠体重明显降低，肝脏重量增加，血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平上升。组织病理学检查发现，PFOS暴露组大鼠的肝脏出现明显的炎症浸润和空泡化。PFOS明显上调大鼠肝脏凋亡相关蛋白，如剪切型PARP、Caspase-3和Bax蛋白水平，抑制Nrf2通路相关的总Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO-1)以及核Nrf2蛋白表达水平。其次，HepG2细胞经0-50μM PFOS暴露1-24 h后，细胞活力降低、细胞膜完整性被破坏。同时，PFOS显著升高细胞内ROS水平，降低还原型GSH含量和线粒体膜电位，上调与凋亡相关指标性蛋白的表达。此外，PFOS明显抑制HepG2细胞的总Nrf2、HO-1、NQO-1和核Nrf2蛋白的表达水平和抗氧化元件(ARE)活性。上述动物和细胞的实验结果表明，PFOS降低肝脏功能，引起肝脏细胞氧化应激、凋亡、氧化损伤和抑制Nrf2信号通路。进一步研究发现，PFOS上调肝脏和HepG2细胞的miR-155水平，而过氧化氢酶(CAT)显著降低PFOS引起的HepG2细胞ROS水平升高和miR-155表达。miR-155抑制剂能够明显抑制PFOS引起的HepG2细胞毒性、氧化应激、细胞凋亡和抑制Nrf2信号通路。以上表明结果，miR-155通过调控Nrf2信号通路参与PFOS诱导的氧化应激和细胞凋亡和氧化损伤。因此，miR-155可作为PFOS诱导肝脏氧化损伤的生物标志物和治疗靶点。 2.PFOS对肝细胞自噬和凋亡的影响。HepG2细胞经PFOS(20 mg/L)暴露处理24 h后，细胞内酸性囊泡和自噬小泡的数量显著升高，自噬相关蛋白(LC3Ⅱ、Beclin-1和Atg5)表达水平上升，而细胞p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K表达水平受到抑制。此外，PFOS上调Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达，下调Bcl-2表达，升高Annexin-Ⅴ-FITC阳性细胞的数量。NAC显著抑制细胞自噬和凋亡。同时，自噬抑制剂3-MA显著抑制PFOS诱导的细胞凋亡，而凋亡抑制剂Z-VAD降低PFOS诱导的细胞自噬水平，升高细胞活力。进一步研究发现，Bcl-2蛋白高表达明显降低PFOS诱导的细胞自噬和凋亡，沉默Bcl-2蛋白表达则促进细胞自噬和凋亡。当自噬相关蛋白Beclin-1表达增加时，PFOS诱导的细胞自噬和凋亡水平也升高。以上结果表明，PFOS诱导的氧化应激通过抑制Akt/mTOR信号通路，调节Bcl-2/Beclin-1的表达，引起细胞自噬和凋亡。 3.PFOS对大鼠肝脏和肝细胞脂质代谢的影响。正常饮食和高脂饮食条件下，SD大鼠分别连续灌胃1和10 mg/kg/day PFOS28天后，PFOS明显增加肝脏重量，同时降低白色脂肪组织重量。同时，PFOS降低血清总胆固醇、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-c)、甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(NEFA)的水平，引起肝脏空泡化、脂滴聚集以及TG水平显著上升，显著抑制肝脏TG输出。PFOS显著上调肝脏脂质代谢相关的脂质转运蛋白CD36表达水平，下调线粒体脂质β氧化关键酶(CPT1a)和脂肪酸合成关键酶(FASN)的表达。此外，PFOS（80μM）引起肝实质细胞的脂滴堆积增加，CD36、LXRα、PXR和PPARγ的表达水平升高。当细胞的CD36沉默后，其TG和脂滴堆积水平降低。同时，PFOS明显上调肝脏和肝细胞的miR-33水平抑制CPT1a蛋白表达。若miR-33受到抑制，肝细胞TG和脂滴堆积显著降低。以上结果表明，miR-33参与PFOS引起肝脏和肝细胞脂质代谢紊乱的作用。
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