摘要
目的：筛选新型吖啶酮类化合物 LZY13作为逆转剂，研究其对肿瘤细胞多药耐药性的体外逆转作用，并探讨其可能的逆转作用机制。 方法：以人白血病K562细胞和耐阿霉素人白血病K562/ADM细胞为研究对象，应用MTT法检测LZY13和阿霉素（ADM）对细胞增殖的抑制作用，测定K562/ADM细胞对ADM的耐药倍数；应用MTT法筛选出LZY13对K562和K562/ADM细胞的无毒剂量，检测其对多药耐药肿瘤细胞耐药性的体外逆转作用；应用高内涵活细胞成像系统检测LZY13对K562和K562/ADM细胞内ADM和罗丹明123（Rh123）蓄积的影响；应用MTT法检测LZY13联用抑制剂后对K562/ADM细胞增殖的影响，并进一步观察LZY13发挥逆转作用可能的信号通路；应用流式细胞术分析LZY13对ADM诱导K562/ADM细胞凋亡、自噬和活性氧（ROS）产生的影响；应用Western Blot方法检测LZY13对人白血病耐药细胞K562/ADM中P-gp以及抑癌基因p53等相关蛋白表达的影响。 结果：MTT检测结果显示，ADM对K562和K562/ADM细胞的IC50值分别为（1.06±0.12） mg/L和（74.15±6.52）mg/L，K562/ADM细胞对ADM的耐药倍数为70倍。MTT结果表明，当LZY13的浓度在1μmol/L及其以下剂量时，其对两种细胞的抑制率均小于10%，对细胞增殖无明显影响。因此，1μmol/L及其以下浓度为LZY13的无毒剂量。MTT法检测显示，LZY13在无毒剂量（0.1~1μmol/L）下能够剂量依赖性地降低ADM对耐药细胞 K562/ADM的 IC50值，在体外成功逆转了人白血病耐药细胞K562/ADM对ADM的耐受性，且其逆转倍数呈剂量依赖性地增加。同等浓度（1μmol/L）下，LZY13的逆转作用比阳性对照药维拉帕米（Verapamil）强59.88倍，逆转效果明显优于后者。阿霉素蓄积实验和罗丹明蓄积实验结果表明，LZY13可剂量依赖性地增加多药耐药细胞K562/ADM细胞内ADM、Rh123的蓄积量。流式细胞术和MTT结果显示，LZY13（0.5?M）与ADM（10 mg/L）联用以后，人白血病耐药细胞 K562/ADM的凋亡细胞数量显著增加，用 caspase家族抑制剂Z-VAD-FMK处理细胞后，LZY13与ADM联用组的细胞凋亡率和细胞抑制率均明显下降。MDC染色和MTT法检测结果表明，LZY13可促进ADM诱导K562/ADM细胞发生自噬，LZY13与ADM联用后，MDC染色荧光强度增强，K562/ADM细胞自噬比率明显增加，相应地其细胞抑制率也明显升高；加入3-MA后，LZY13与ADM联用组的细胞自噬比率及细胞抑制率均显著降低。细胞内ROS水平检测结果显示，LZY13与ADM联用后，DCF染色阳性细胞明显增多即细胞内 ROS含量显著增加，同时其细胞生长抑制率亦明显升高；加入抗氧化剂Catalase处理细胞后，K562/ADM细胞内ROS含量及其细胞抑制率均显著下降。通过Western Blot分析可知，耐药细胞K562/ADM中P-gp蛋白呈高表达，经LZY13与ADM联用处理后的细胞，P-gp蛋白的表达显著下降；另外，LZY13与ADM联用后，抑癌基因p53的表达增多，加入Pifithrin-α处理细胞后，p53的表达明显下降。 结论：吖啶酮类化合物LZY13在体外可有效逆转人白血病耐药细胞K562/ADM对ADM的耐受性，能够有效恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。LZY13逆转肿瘤细胞多药耐药的作用机制可能是与抑制 P-gp蛋白的药物外排功能，增加细胞中化疗药物的浓度，促进化疗药物对耐药细胞的凋亡诱导作用，促使化疗药物诱导耐药细胞发生自噬，引起耐药细胞内ROS含量升高以及上调肿瘤抑制基因p53的蛋白表达有关。
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