摘要
板蓝根是我国常用经典中药材，入药已逾2000余年，最主要的功效就是防治呼吸道病毒性疾病。2000版《中国药典》规定板蓝根为十字花植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根。已有诸多学者对其化学成分进行了研究，研究结果显示板蓝根化学组成复杂，但没有哪一种成分是板蓝根中的主要化学成分。虽然有研究报道板蓝根中的一些成分具有抗病毒活性，但并未获得共识。为了进一步阐明板蓝根的抗病毒物质基础及药理作用机制，本课题采用活性追踪为导向的化学成分分离策略，筛选有效化合物并进行药理作用研究。本论文完成的主要工作及结果如下。 一、板蓝根抗流感病毒活性成分的追踪和分离 1、采用传统水提取工艺对板蓝根药材进行提取，得到板蓝根水提取物，水提取物经60%乙醇沉淀，取上清液，上清液经大孔树脂吸附，依次使用蒸馏水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇依次洗脱，将水提取物分为不同的极性组分；采用体外抗流感病毒细胞模型对各组分进行抗病毒活性筛选，得到具有较好抗流感病毒活性的水洗脱部分（D组分，命名为S-03）和40%乙醇洗脱部分（F组分）。对其中的D组分采用了透析袋透析的方法进一步分离，得到具有抗流感病毒活性的 G2,将 G2上凝胶柱进行层析分离纯化，得到具有显著抗流感病毒活性的多糖G2-1。对另一活性组分F进行大孔树脂及Sephadex LH-20柱层析及制备 HPLC分离，得到2个活性显著的单体化合物，经鉴定分别为吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（M5）和（R，S）-告依春（M6）。目前尚无多糖G2-1、吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷体内外抗流感病毒作用报导。 2、为了对板蓝根药材中的活性多糖类物质进行全面探索，明确板蓝根多糖的化学结构，采用热水回流提取、乙醇分步沉淀的方法对板蓝根多糖进行分离和活性追踪，发现该方法较好的将活性多糖集中在70%～90%醇沉层，利于进一步分离纯化得到活性较好的均一多糖。 二、板蓝根有效成分多糖的抗流感病毒作用机制 1、板蓝根多糖体外细胞模型及血凝抑制试验对甲型H1N1流感病毒PR8株、FM1株、季节性甲型H1N1流感病毒株、新甲型H1N1流感病毒株、甲型H3N2流感病毒Aichi株、甲型H6N2流感病毒株、甲型H7N3流感病毒株及低致病性H9N2禽流感病毒株、乙型流感等不同亚型的流感病毒具有抑制作用,对其他呼吸道病毒无抑制作用，提示具有选择性抑制流感病毒作用。此外，G2不易诱导流感病毒产生耐药株。 2、S-03对神经氨酸酶无直接抑制作用。 3、作用时相实验结果显示 G2作用于病毒感染的早期阶段（0-1小时），同时结合血凝抑制实验结果提示G2可能作用于流感病毒的血凝素，抑制流感病毒吸附而阻断感染。 4、通过竞争性elisa试验的结果，进一步证实了板蓝根多糖G2-1可以与流感病毒PR8株的HA蛋白结合，推测HA可能为G2-1作用于流感病毒的其中一个靶点。 5、由于G2-1并非均一多糖，且得率较低，所以只进行了血凝抑制和竞争性Elisa法试验。 三、板蓝根有效成分M5的体内外抗流感病毒作用机制 1、M5体外细胞模型对甲型H1N1流感病毒PR8株、FM1株、新甲型H1N1流感病毒株、甲型H6N2流感病毒株及低致病性H9N2禽流感病毒株均有抑制作用。 2、M5对流感病毒膜蛋白血凝素无直接抑制作用。 3、作用时相实验结果显示，病毒感染前2小时给予M5可显著抑制流感病毒的复制，说明M5在病毒感染前对细胞有保护作用。 4、M5对小鼠感染 H1N1流感病毒致肺炎具有抑制作用。M5在高剂量组(900 mg/kg/day)的肺指数为1.12+0.35，比病毒对照组（2.002±0.48）显著下降（P＜0.05） 四、结论 （1）板蓝根多糖、吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和吿依春为板蓝根的特异性抗流感病毒有效成分。 （2）板蓝根多糖和吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有体外抗多种流感病毒的作用 （3）板蓝根多糖的作用机制可能为作用于流感病毒血凝素，从而抑制流感病毒吸附而阻断感染。 （4）吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的作用机制可能为在病毒感染细胞前对细胞进行保护作用，从而抑制病毒复制。 本研究为板蓝根的抗病毒物质基础和药理研究提供了更多的基础资料，为进一步研发现代板蓝根中药奠定基础。
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