摘要
目的： 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种能造成严重社区和医院获得性感染的致病菌，它不仅可以引起皮肤粘膜脓肿、中耳炎等常见感染,还可以引起脑膜炎和菌血症等严重感染。金黄色葡萄球菌引发感染的发病率呈上升趋势，耐药问题日益严重，这已经引起了人们的高度重视。乳酸脱氢酶（ lactate dehydrogenase，LDH）催化丙酮酸和乳酸之间的相互转化,它对于金黄色葡萄球菌保持毒力、逃避宿主的先天性免疫以及生物膜形成是至关重要的。因此，本研究在前期对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌L-乳酸脱氢酶的克隆、表达的基础上，制备多克隆抗体，分析其免疫活性及交叉反应性，并进一步分析了该多克隆抗体对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响,为其后续诊断、治疗研究奠定基础。 方法： 复苏pET28a-ldh1/Bl21重组菌，提取pET28a-ldh1重组质粒进行双酶切鉴定。IPTG诱导重组融合蛋白表达、以抗His标签的单克隆抗体进行免疫印迹法（Western-blot）鉴定重组蛋白。以IPTG诱导后，溶菌酶以及超声裂解后收集上清，Ni2+柱纯化蛋白。透析和浓缩纯化蛋白后分析其酶活性和理化性质。使用纯化的重组蛋白以及相应的佐剂免疫小鼠，收集小鼠抗血清，利用ELISA测定血清抗体效价。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白后，使用小鼠抗血清进行免疫印迹法鉴定重组蛋白的免疫反应性。收集金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌以及重组菌，经溶菌酶和超声破裂后离心取上清进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后进行Western-blot鉴定L-乳酸脱氢酶多克隆抗体的交叉反应性。最后以结晶紫为染料，30%的醋酸为脱色剂，于570 nm波长下测定吸光值，进一步分析该多克隆抗体对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。 结果： 重组质粒pET28a-ldh1双酶切后获得大小约950 bp的目的条带，诱导表达后SDS-PAGE电泳在约39 KDa处可见目的条带，免疫印迹法验证了重组L-LDH的表达。Ni2+柱纯化后获得2.8 mg重组蛋白，酶活性为14100 U/L，三级结构预测该重组蛋白为四聚体。纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答， ELISA检测特异性IgG效价，小鼠抗血清效价达1:50000。Western-blot鉴定显示所制备的多克隆抗血清能分别识别金黄色葡萄球菌重组及天然L-乳酸脱氢酶，但不识别表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌中天然乳酸脱氢酶。生物膜形成抑制实验显示该多克隆抗体在稀释倍数为1:1000时抑制率为66.4%，在稀释倍数为1:2000时的抑制率为41.4%，在稀释倍数为1:4000时的抑制率为16.2%。 结论： 纯化的L-LDH具有良好的免疫活性，免疫小鼠获得高滴度的多克隆抗体。使用 Western-blot鉴定显示该多克隆抗体具有很好的特异性。并且该多克隆抗体对金黄色葡萄球菌生物膜形成具有一定的抑制作用。为后续使用该重组蛋白进行金黄色葡萄球菌感染的诊断和防治研究奠定基础。
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