摘要
近年来可视化识别生物和环境的重要物种一直是一个重要的研究课题。与其他分析工具相比，小分子荧光传感器有几个优点，包括操作简便，检出限低，高选择性，最重要的是，利用共焦显微镜生物成像，它们已然成为监测生物体外和体内相关物种的有效工具。与单光子荧光显微术相比，双光子荧光显微术采用两个近红外光子作为激发源，具有多种优势，包括能深度组织成像、较高的空间分辨率和较长的观测时间。此外，随着双光子荧光显微术的出现，双光子荧光传感器能够使小鼠和组织的生物样标本可视化。因此，双光子小分子荧光传感器在过去的十年间蓬勃发展，广泛应用于化学，生物化学，医学和环境等领域。 线粒体属于膜结合型的细胞器，也是主要能源生产场所。线粒体在真核细胞中的多种重要的生理过程和疾病（表现为异常细胞凋亡反应，如癌症）发挥关键作用，这使它们成为设计新型抗癌药物的目标。由于金亲脂性复合物在高线粒体膜电位的驱动下可以在细胞的线粒体中积累，几种不同类别的Au(Ⅲ)配合物作为潜在的抗肿瘤剂而备受瞩目。然而，金盐通过与生物分子不可逆的相互作用而在一些生物系统中有很高的毒性，最终会损害肝脏、肾脏和神经系统。特别是Au3+，它对DNA有很强的亲和力而导致DNA严重损伤。因此，我们急需制定有效的方法来专一、快速、实时监控环境，药物和潜在的生命系统中Au3+离子。 通过查阅和研讨大量文献，在我们组先前工作的基础上，本文通过对结构修饰，着重改进荧光传感器配位原子的类型和席夫碱受体的配位方式，设计合成了三种新型的高选择性识别Au3+的双光子荧光传感器。通过1H NMR、13C NMR、质谱等方法来表征这几种荧光传感器的结构，并通过紫外光谱，荧光光谱等光谱法研究了它们的光学性能，利用双光子共聚焦荧光显微镜对传感器进行了细胞成像，线粒体定位成像，组织成像，部分还进行了活体成像，并取得了一系列有意义的结果。该论文主要包括以下三个部分: 一、简单介绍了双子荧光及其显微成像技术和线粒体靶向的荧光传感器。 二、之前，我们课题组报道了一个线粒体靶向双光子荧光传感器(PyCM)对金离子的检测，基于金离子诱导C=N键水解机理。然而，传感器PyCM不能区分Au3+和Au+，可能是因为PyCM受体中“N^N”组合对Au3+和Au+有类似的亲和性。根据软硬酸碱理论，硬供电子原子如N和O往往用于绑定的硬金属离子Au3+，因此，我们希望通过调节传感器PyCM的“N^N”组合为新的“N^O”组合来开发了一个高选择性识别Au3+的双光子荧光传感器(PyCM-1)。当Au3+存在时，PyCM-1的荧光明显增强，并且具有较低的检测限(22 nM)、大的双光子吸收截面(696 GM，860 nm)。与此同时，通过紫外可见光谱法，1HNMR滴定法和质谱证明了PyCM-1识别Au3+的反应机理与PyCM识别Au3+/Au+的机理是一致的。此外，PyCM-1作为双光子荧光传感器还可以有效检测线粒体，小鼠肝脏组织和斑马鱼中的Au3+。 三、在PyCM-1的基础上，我们还以调整传感器受体中“N^O”组合为“N^S”组合的策略设计合成了双光子荧光传感器PyCM-2和PyCM-3。我们发现尽管在水溶液中通过席夫碱受体对Au3+荧光增强响应的机理已经被提出:传感器首先与Au3+快速配位（即C=N键异构化受限），然后通过水对C=N键的进攻水解生成相对应的的产物，但是未被实验充分证实。在本实验中我们系统地证明了Au3+诱导水解反应整个的过程。当Au3+加入时，PyCM-3的荧光明显增强，并具有较低的检测限(6 nM)和较大的双光子吸收截面(685 GM，860 nm)以及良好的生物相容性。与PyCM和PyCM-2相比而言，在水溶液中PyCM-3表现出对Au3+的专一选择性，且没有受到Hg2+和Au+的干扰。共聚焦荧光成像实验表明PyCM-3在双光子激发下可以用来检测线粒体、组织和斑马鱼中的Au3+。
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