摘要
低温胁迫是一种典型的非生物胁迫，对作物的生长与发育过程、产量及品质具有严重影响。近年，全球气候虽然不断变暖，但是异常天气如冬季严寒和倒春寒等的极端天气时有发生;同时，随着近年油菜种植结构的变化、油菜北移以及油菜占据丘陵山地均对抗寒性提出了更高的要求。开展甘蓝型油菜抗寒基因定位研究，是抗寒基因克隆和转基因育种的前提和基础，对加快抗寒种质创制和抗寒品种选育具有重要的理论和实际意义。 本研究以强抗寒性的甘蓝型油菜GZ恢和弱抗寒性10B、及GZ恢×10B形成的F2群体、F2∶3家系为研究材料，两年两个环境条件下对上述双亲及后代群体进行自然低温胁迫，通过越冬冻害调查、生理指标分析及SSR标记等对后代群体冻害变化规律、生理指标和冻害表现的相关性、冻害遗传图谱及控制冻害QTL等进行研究，主要得到以下研究结果: 1.通过两年两点试验对双亲、150个F2及150个F2∶3家系进行冻害指数(DL)的调查，并对双亲及F2∶3家系进行另外5个生理指标叶片组织相对含水量(RWC)、叶片相对电导率(EC)、可溶性蛋白(SP)、丙二醛(MDA)及SPAD值测定。结果显示，杨凌点GZ恢和10B的DL平均值分别为为2.10和3.30;永寿点GZ恢和10B的DL平均值分别为2.79和3.67，两点双亲间冻害指数均差异极显著。两点F2群体单株的DL值在1.00-4.00之间，符合正态分布，均存在超亲分离现象。杨凌点和永寿点F2∶3家系DL值在1.50-4.20之间和2.42-3.79之间，均符合正态分布，且存在超亲分离，用F2∶3家系抗寒性来衡量F2单株的抗寒性较可靠。 2.通过对杨凌和永寿两点F2群体单株冻害指数与F2∶3家系的5个生理指标(RWC、EC、SP、MDA、SPAD)测定结果进行相关性分析，结果表明，F2群体单株冻害指数与次年杨凌点对应F2∶3家系的DL、MDA、SPAD及SP呈极显著或显著相关，相关系数分别为0.621、0.601、0.338、0.326; F2群体单株冻害指数与次年永寿点F2∶3家系的DL、EC、RWC、MDA、SP呈显著或极显著相关性，相关系数分别为0.505、0.482、0.560、0.456、0.295，与SPAD相关性较弱。各指标间的相关性永寿点高于杨凌点，其中永寿点冻害指数与RWC、EC、SP存在极显著相关性，相关系数分别为0.542、0.402、0.459; RWC与SP、MDA、EC也呈极显著相关性，相关系数为0.393、0.459、0.624; MDA与SP、EC呈极显著相关性，相关系数为0.593、0.523。杨凌点F2∶3家系DL与RWC、SPAD及SP显著相关相关系数为0.206、-0.216、0.190; SPAD与EC呈显著相关性，相关系数为0.293。双亲在杨凌点和永寿点的5个生理指标多表现差异显著，F2∶3的5个生理指标均符合正态分布且存在超亲分离现象，适合进行QTL定位研究。 3.利用1030对分布于甘蓝型油菜基因组A和C上的SSR引物对双亲进行筛选，共选出221对SSR引物在“GZ恢”和“10B”之间表现出多态性;用221对SSR多态性引物筛选150个F2单株，共有177对引物在F2群体中表现多态性，多态率为80.1％，多态性位点333个。利用JoinMap4.0对在147个F2群体单株间具有差异的333个SSR标记进行连锁性分析，建构了一张包含有19个连锁群、总长为1317.70cM的甘蓝型油菜遗传连锁图谱，标记的总个数为290个，其中有43个未被列入连锁群内，连锁群上两个相邻的标记之间的平均遗传距离为4.54cM。各连锁群上标记个数在5-42个之间，连锁群长度在17.00-145.70cM之间。 4.用杨凌、永寿两点F2∶3家系各性状的平均值来代表其对应F2群体单株的表型值，利用WinQTLcart2.5，采用复合区间作图法(CIM)进行QTL分析，取LOD≥2.5。结果共得到20个与甘蓝型油菜抗寒性状相关的QTLs，LOD值介于2.54-5.87之间，20个QTLs变异幅度较大，其中qMDAYS-6贡献率最高，为42.501％，位于A8染色体上，介于BrgMs372-BrgMs5339之间;贡献率最低的为qECYL-8，为0.005％。其中A7、A8和A10染色体中均检测到了QTL的热点区域，qSPADYS-7与qMDAYL-7共享A7染色体的BrgMS587-BnGMS488区域;qSPADYL-8与qMDAYS-8共享A8染色体的BrgMS653-BrgMS5339区域;A10染色体的BrgMS321-Na12A06区域同时控制着qSPADYL-10与qSPYL-10。 5.在NCBI数据库里搜索芸薹属作物中与抗寒相关的基因，只得到一个基因即AT5G30510，将该基因序列与油菜数据库进行同源基因的比对，得到Bra010018和Bra036120两个基因，分别位于A5染色体11611983-11634456bp、A6染色体3122514-3138050bp之间。本研究在A5和A6染色体上同样也定位到了相应的QTL，由于遗传连锁图谱的分子标记的密度较低，使得定位出的QTL与基因之间并没有重合区域，但两者相距很近，其中A5染色体上与Bra010018基因最近的标记为BrgMs70-2，相差0.577M; A6染色体上与Bra036120基因最近的标记为BnGMS280-2，相差0.588M。
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