摘要
白蚁是一种社会性昆虫。因为它们对于木质纤维素强大的降解能力，所以在生态圈的碳循环中发挥重要的作用。根据肠道共生物中是否包含原生动物，可将白蚁分成低等白蚁和高等白蚁。高等白蚁中与真菌共生的白蚁为培菌白蚁。培菌白蚁的食物中包含真菌孢子，而孢子的细胞壁主要成分是几丁质，故培菌白蚁肠道中可能存在几丁质酶来起着降解真菌孢子细胞壁的作用。 黄翅大白蚁是培菌白蚁的一种，目前对培菌白蚁来源昆虫几丁质酶的研究是非常有限的。分析黄翅大白蚁肠道转录组测序结果后，我们从中筛选出功能注释为几丁质酶的基因，对它们进行生物信息学分析。本研究主要对其中可能参与代谢的几丁质酶基因进行了基因克隆和功能性表达，具体内容如下: 1.本文先对黄翅大白蚁转录组测序结果进行分析，通过关键词“chitinase”搜索，发现有40个功能注释为几丁质酶的unigenes。将这40个几丁质酶基因进行一系列生物信息学分析，并对其中三个基因进行进一步功能的探索。 2.Unigene基因comp133624_c0的在前肠中相对表达量最高，为277.21。该片段进行生物信息学分析之后，设计引物，通过PCR得到cDNA全长，在大肠杆菌JM109中表达;unigene基因comp174658_c0的中肠相对表达量最高，523.34。对该片段进行生物信息学分析之后，设计引物，通过PCR得到cDNA全长，然后将该基因在大肠杆菌JM109中和BL21(DE3)以及毕赤酵母中异源表达;unigene基因comp182537_c0在中肠和后肠的相对表达量都相对较高，分别为750.43和1638.2。该片段编码一个含有CBM-14（结合域）的几丁质酶，并且设计引物，通过PCR得到cDNA全长并克隆到在大肠杆菌JM109中和BL21(DE3)表达。 3.为了进步一确认上述三个基因的优势表达部位，我们还对上述基因进行了qPCR和RT-PCR验证，证实是否与转录组测序结果的优势表达位点相吻合。 总之，本研究成功克隆得到三个几丁质酶基因，而且在大肠杆菌异源表达。它们的重组蛋白均能检测到几丁质酶活性，但是几丁质酶活性不高。这种现象可能是因为昆虫来源蛋白在大肠杆菌中表达时，重组蛋白没得到很好的修饰和折叠，导致大多数重组蛋白都形成了包涵体。另外，unigene基因comp174658_c0在毕赤酵母中异源表达且表达产物具有降解几丁质的能力。最后，qPCR和RT-PCR的结果显示:除了基因comp174658_c0外，另外两个基因在各个部位的表达水平趋势与转录组测序结果相符合。 关键词:黄翅大白蚁;几丁质酶基因;克隆;功能性表达
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