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自噬对LPS诱导的单核巨噬细胞RAW264.7凋亡和吞噬的影响及其机制的初探
陈华玲1
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摘要
【目的】 1.通过观察LPS诱导RAW264.7单核巨噬细胞损伤模型及自噬水平的变化。 2.检测自噬抑制剂氯喹干预损伤的RAW264.7细胞后的自噬、吞噬、凋亡及炎症水平的变化。 3.初步探讨自噬在炎症反应中的作用及其可能的机制。 【方法】 首先，MTT法检测不同浓度的LPS对RAW264.7细胞损伤的影响以确定造模浓度，接着采用MTT法筛选氯喹对RAW264.7细胞无毒性作用的浓度，最后采用MTT法检测不同浓度的氯喹对LPS诱导RAW264.7细胞损伤的干预作用；采用巨噬细胞吞噬中性红能力来检测 RAW264.7细胞的吞噬功能；采用DCFH-DA荧光探针结合荧光显微镜和流式细胞仪检测不同浓度的氯喹作用于LPS诱导RAW264.7细胞损伤后活性氧（ROS）水平；Western Blot法检测不同浓度氯喹对 LPS诱导 RAW264.7细胞损伤后相关蛋白 LC3、p62、Cleaved caspase-3、NF-κB p65、TNF-a蛋白的表达变化水平。 【结果】 1.不同浓度LPS在不同时间下对RAW264.7细胞损伤的影响：MTT结果显示低剂量LPS（10 mg/L）随着时间增加呈现细胞增殖作用（P＜0.01），当LPS浓度大于100 mg/L时，RAW264.7细胞活力随着LPS浓度和时间的增加而显著减少（P＜0.01），200 mg/L的LPS作用24h细胞损伤达到50%左右。 2.氯喹对 RAW264.7细胞活力的影响：MTT结果显示随着氯喹浓度的增加，细胞活力逐渐下降，1.25μM、2.5μM、5μM氯喹对细胞活力没有影响（P＞0.05）。 3.氯喹对 LPS诱导 RAW264.7细胞损伤的干预作用：MTT结果显示200mg/L LPS诱导细胞损伤，1.25μM、2.5μM氯喹组呈现细胞活力增加的保护作用（P＜0.05），而5μM氯喹没有统计学意义（P＞0.05）。 4.氯喹对LPS诱导RAW264.7细胞形态的影响：正常组巨噬细胞呈圆形，单独LPS刺激组可见大部分细胞两极分化、伸出长长的伪足；而加1.25μM CQ、2.5μMCQ组的细胞伪足减少、细胞呈圆形或梭形；加5μM CQ组的细胞则仍有少部分长伪足。 5.氯喹对LPS诱导RAW264.7细胞吞噬中性红的影响：小剂量 LPS可促进巨噬细胞吞噬中性红，尤以30mg/L LPS最为显著（P＜0.01），而大于100mg/L LPS使巨噬细胞吞噬能力下降（P＜0.05）；单独氯喹对巨噬细胞吞噬能力没有明显变化（P＞0.05）；而在LPS刺激下加入0.625μM、1.25μM、2.5μM氯喹可提高巨噬细胞吞噬能力（P＜0.05），10μM氯喹降低吞噬能力（P＜0.05）；巨噬细胞吞噬中性红的能力呈时间依赖性，在60min时吞噬中性红达到饱和。 6.一定浓度氯喹能够降低LPS诱导RAW264.7细胞内ROS水平：荧光显微镜结果显示200mg/L LPS模型组荧光强度高于正常组（P＜0.05），加1.25μM、2.5μM氯喹组荧光强度低于模型组（P＜0.05），加5μM氯喹组与模型组荧光强度差别不大（P＞0.05）；流式细胞仪结果显示正常组的ROS水平为37.3%，模型组的ROS水平为58.0%，加（1.25μM、2.5μM、5μM）氯喹组的ROS水平分别为40.0%、40.2%、53.0%，可见加入氯喹可降低ROS水平。 7.Western blot检测结果显示：200mg/L LPS刺激RAW264.7细胞的LC3Ⅱ/Ⅰ水平随着时间增加而积累，表明自噬表达水平呈时间依赖性；与空白对照组相比，模型组的LC3Ⅱ/Ⅰ、Cleaved caspase-3、NF-κB p65、TNF-a蛋白表达均显著增加（P＜0.01），而加入1.25μM、2.5μM氯喹组均可逆转LPS对模型组的损伤作用，使以上蛋白表达减少（P＜0.01），加5μM氯喹组除了 LC3蛋白，其它蛋白表达均无统计学意义。p62蛋白表达趋势与LC3Ⅱ/Ⅰ相反，抑制自噬可导致p62蛋白的积累。 【结论】 1. LPS诱导RAW264.7细胞损伤的自噬水平明显上调。 2.自噬抑制剂氯喹预处理可减轻RAW264.7细胞损伤程度和提高巨噬细胞的吞噬能力。 3.自噬抑制剂氯喹拮抗LPS诱导RAW264.7细胞损伤与降低过度自噬有关，其机制可能是通过抑制NF-κB激活，下调LC3、Cleaved caspase-3及TNF-a蛋白表达，上调p62蛋白的表达实现。
关键词
RAW264.7单核巨噬细胞/LPS诱导/氯喹/细胞自噬/细胞凋亡/细胞吞噬/炎症反应/抑制机制引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
药理学导师
马晓鹂/吴科锋学位年度
2016学位授予单位
广东医学院语种
中文中图分类号
R3