摘要
鹿角菜(Pelvetia siliquosaTsenget C.F.Chang)隶属褐藻门（Phaeophyta）、圆子纲（Cyclosporeae）、鹿角菜目（Fucales）、鹿角菜科（Fucaceae）、鹿角菜属（Pelvetia）。目前，尚未有对鹿角菜中岩藻多糖的分离、纯化以及生物活性进行研究的报告。本论文对鹿角菜中岩藻多糖的最佳提取工艺、分离纯化以及免疫活性进行研究。 文章共包括三个部分，即响应面法优化鹿角菜中岩藻多糖的提取工艺、鹿角菜中岩藻多糖的分离纯化、鹿角菜中岩藻多糖的免疫活性研究。 第一部分：响应面法优化鹿角菜中岩藻多糖的提取工艺 （1）传统水提法：研究液料比、水浴温度和水浴时间三个参数对岩藻多糖提取率指标的影响，并采用Box-Benhnken设计（BBD）来优化岩藻多糖提取工艺。传统水提法最佳提取工艺条件为：液料比32mL/g、水浴温度90℃、水浴时间8.4h，此时岩藻多糖最高提取率为5.2005%，与理论值5.2153%相比，相对误差很小； （2）超声波辅助法：研究超声波时间、液料比、水浴温度和水浴时间四个参数对岩藻多糖提取率指标的影响，并采用Box-Benhnken设计（BBD）来优化岩藻多糖提取工艺，确定超声波辅助提取法最佳条件为：液料比51 mL/g，水浴温度91℃，超声时间60 min，水浴时间5 h。在此条件下，岩藻多糖提取率达到5.961%，与理想预测值（5.993%）相比，相对误差小于5%； 与传统水浴提取对比，超声波辅助提取法总时长缩短了2.4 h，多糖提取率提高了0.79%。 第二部分：鹿角菜中岩藻多糖的分离纯化 （1）通过Q-Sepharose Fast flow阴离子交换柱层析和Superdex-200、Superdex-75葡聚糖凝胶柱层析对超声波辅助最佳工艺提取获得的粗多糖进行分离纯化，最终主要获得四个纯度高的岩藻多糖组分：PSF1、PSF2、PSF3和PSF4。其对应的分子量分别为：407.735KDa、7.646KDa、18.121KDa和20.529KDa。 （2）由红外光谱分析发现四个岩藻多糖组分均含有多糖特征峰。分离纯化获得的四组岩藻多糖分子量相差较大，其中PSF1分子量最大，硫酸根含量也最高。四个岩藻多糖组分不含有糖醛酸，且PSF4不含硫酸基团，因此初步判定PSF1、PSF2、PSF3为不含糖醛酸的岩藻多糖，PSF4为不含硫酸基团的岩藻多糖。 第三部分：鹿角菜中岩藻多糖的免疫活性研究 本试验主要通过测定离子交换柱层析法和进一步葡聚糖凝胶柱层析分离纯化后的岩藻多糖组分对巨噬细胞 Raw264.7细胞存活率、NO释放量以及吞噬活性的影响来反应其免疫活性，并对其影响进行比较。 （1）采用MTT法测定不同岩藻多糖对Raw264.7细胞活力的影响，发现离子交换柱层析获得的组分 PSF-W、PSF-0.2N、PSF-0.4N、PSF-0.8N以及再次经过凝胶色谱柱纯化的岩藻多糖组分 PSF1、PSF2、PSF3、PSF4在25-400μg/mL浓度范围内对Raw264.7细胞是安全的，无细胞毒性。 （2）在对LPS诱导Raw264.7细胞释放NO的实验中发现，岩藻多糖组分PSF1和PSF3与对应的粗多糖PSF-W、PSF-0.4N对细胞释放NO的浓度影响相差显著，明显高于粗多糖对细胞释放NO的浓度影响，而多糖组分PSF2和PSF4与对应的粗多糖PSF-0.2N、PSF-0.8N对细胞释放NO的浓度影响差异很小。 （3）在Raw264.7细胞吞噬活性的实验中发现，岩藻多糖组分PSF1、PSF2和PSF3与对应的粗多糖PSF-W、PSF-0.2N和PSF-0.4N对细胞的最大吞噬活性相差显著，且明显高于粗多糖对细胞吞噬活性的影响，而多糖组分PSF4与对应的粗多糖PSF-0.8N对细胞的最大吞噬活性相似且较弱。 （4）采用Griess试剂法测定NO的释放量以及中性红吞噬实验中发现，分子量最大且硫酸基含量最多的PSF1的NO释放量最大和吞噬活性最高；分子量相似且硫酸基含量低的PSF3和PSF4的NO释放量和吞噬活性相似；分子量小且硫酸基含量低的PSF2的NO释放量最小，吞噬活性最弱。因此硫酸基含量高且分子量大的岩藻多糖有更强的免疫活性。
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