摘要
目的： 探讨PLCE1对食管鳞癌自噬水平的影响；研究下调食管鳞癌中沉默PLCE1所诱发的自噬水平对癌症细胞凋亡的影响；初步研究PLCE1调控食管鳞癌自噬水平的分子机制。 方法： （1）用PLCE1 siRNA转染食管鳞癌细胞系Eca-109、TE-1，应用MDC染色、AO染色及细胞免疫荧光检测方法，检测下调PLCE1表达对肿瘤细胞内自噬水平的影响； （2）运用自噬特异性抑制剂3-MA或Beclin-1 siRNA，抑制由沉默PLCE1表达所诱发的自噬，运用MDC染色检测食管鳞癌细胞内的自噬水平，通过MTT方法、流式细胞仪检测凋亡方法检测肿瘤细胞的凋亡和增殖水平受到的影响，应用Western Blot方法检测自噬相关分子Beclin-1和LC3的表达水平，以及凋亡相关分子cleaved-PARP、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3的蛋白表达水平； （3）根据课题组前期研究结果，运用WesternBlot实验检测miR-106b-5p的宿主基因MCM7的表达，结合TargetScan，miRanda，DIANAmT，miRDB，miRWalk等靶基因预测软件分析，运用荧光素酶报告试验检测miR-106b-5p与自噬相关基因Beclin-1之间的靶向关系（；4）在食管鳞癌细胞ECA109内共转染miR-106b-5p模拟物与PLCE1 siRNA，通过MDC染色和AO染色，检测肿瘤细胞内的自噬水平，通过Western Blot方法检测食管癌细胞内自噬基因Beclin-1的表达水平。 结果： （1）使用PLCE1 siRNA转染食管鳞癌细胞系，MDC染色和AO染色的结果显示，沉默PLCE1的表达后，细胞内的自噬囊泡数量明显增多，细胞免疫荧光检测提示LC3蛋白的表达水平明显升高； （2）MDC染色结果显示沉默PLCE1后所诱发的自噬上调可被3-MA抑制；MTT实验结果显示，PLCE1 siRNA和3-MA共同处理的ECA109细胞系和TE-1细胞系的增殖水平与PLCE1 siRNA单独处理组相比有明显升高，Beclin-1 siRNA与PLCE1 siRNA共处理组的细胞增殖水平与对照组及PLCE1 siRNA处理组相比有明显升高；流式细胞术结果显示，PLCE1 siRNA处理组细胞的凋亡水平，在转染3-MA或Beclin-1 siRNA后明显降低；Western Blot结果显示，下调PLCE1蛋白表达后，Beclin-1蛋白及LC3蛋白的表达水平明显升高，3-MA或Beclin-1 siRNA与PLCE1 siRNA共处理组中，cleaved-caspase-3、Bax及cleaved-PARP蛋白的表达水平与PLCE1 siRNA单独处理组相比，表达水平有明显降低，而Bcl-2蛋白的表达水平升高； （3）Western Blot实验结果显示，miR-106b-5p的宿主基因MCM7在沉默PLCE1后表达明显降低；TargetScan，miRanda，DIANAmT，miRDB，miRWalk等靶基因预测软件分析结果显示，miR-106b-5p可能与自噬基因Beclin-1存在靶向关系，荧光素酶报告试验结果显示，miR-106b-5p通过靶向结合3’UTR调控下游基因Beclin-1；Western Blot结果显示，与对照组相比，miR-106b-5p模拟物组的Beclin-1蛋白表达量明显降低； （4）在Eca-109细胞系和TE-1细胞系中转染miR-106b-5p模拟物及PLCE1 siRNA，通过MDC染色和AO染色后发现，共转染miR-106b-5p模拟物及PLCE1 siRNA后，肿瘤细胞内的自噬囊泡数量比PLCE1 siRNA单独处理组也明显降低，Western Blot结果显示，共转染miRNA模拟物及PLCE1 siRNA后，Beclin-1的表达水平与单独转染PLCE1 siRNA的细胞组相比明显降低。 结论： （1）PLCE1的过表达可以下调食管鳞癌细胞内的自噬和凋亡水平，从而促进食管细胞的恶性转化； （2）PLCE1对调控食管鳞癌细胞自噬的分子机制可能是通过上调miR-106b-5p，靶向抑制 Beclin-1的表达，进而下调肿瘤细胞内的自噬过程； （3）本次研究提示通过靶向干预PLCE1的表达，诱导食管鳞癌细胞的自噬，能够成为食管癌治疗的新策略。
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