摘要
在新药研发的初期阶段，药物快速筛选技术为新型先导化合物的发现做出了重要贡献。目前，基于亲和力选择原理的质谱分析技术（ASMS)，由于其实验手段、分析方法不依赖于读取蛋白生物作用，因而在先导化合物的筛选中较传统技术更具优越性。然而，现阶段已报道的ASMS方法各有优劣，适用于各类蛋白配体筛选的通用方法未被建立。因此，为满足药物研发进程中的各种需求，加速先导化合物的发现，需要对药物筛选方法保持持续性的开发与优化。本博士课题主要通过对基于超过滤(UF)、超离心(UC)原理的两种ASMS方法进行开发、优化与应用，以促进ASMS方法学的发展、并扩展其在药物研发进程中的应用。 在第一部分工作中，我们使用文献已报道的糖尿病靶点蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的抑制剂作为小分子模型，通过对比UF-ASMS和体外酶活性方法分别得到的亲和力强度与抑制性强弱的结果，发现其具有一致性，证明了 UF-ASMS法的可行性。UF-ASMS法具有高灵敏度、高选择性、速度快、条件温和、应用范围广等优点，尤其适用于先导化合物的初步筛选。因此，我们运用该方法从2000个化合物中快速筛选出了与蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)具有结合能力的化合物。另外，我们使用UF-ASMS方法，在不进一步分离天然红曲提取物的前提下，筛选、鉴定了其中具有PTP1B选择性结合能力的单体，验证了 UF-ASMS方法能够适用于在未经分离的前提下快速、准确的筛选天然产物中具有特异性靶点活性的单体，从而有效规避了传统分离、分析方法易造成的活性成份丢失、变性等问题；加速对广泛存在于天然产物中的未知化合物的活性研究；对我国中药现代化研究进程起到重要推动作用。 在第二部分工作中，我们验证了 UC-ASMS方法能有效规避普遍存在于UF-ASMS方法中的膜效应，且其蛋白及化合物的用量需求较UF-ASMS方法大大降低，但速度与后者相比较慢。随后，我们应用UC-ASMS方法再次筛选该2000个化合物中具有潜在PTP1B抑制活性的化合物，发现通过两种方法得到的亲和力结果具有较强的相关性，且与体外酶活性方法所得的抑制性结果高度一致，说明了UC-ASMS与UF-ASMS是两种可相互验证的互补技术，能够有针对性的为不同筛选需求提供合适且可靠的实验手段。 另外，针对目前建立的ASMS方法无法对多靶点结合配体进行筛选，我们设计了一种基于密度梯度离心的多靶点同时筛选方法。在该方法中，通过离心力作用使不同分子量的蛋白与化合物在具有浓度梯度的离心介质中根据分子大小进行重新分布、有效分离。最后，通过比对化合物与蛋白离心后的分布情况判断化合物的结合能力。结果表明，蛋白与其具有特异性结合的配体在离心后于介质中的分布情况应当一致。该方法可以为ASMS技术在药物研发进程中的应用提供重要功能扩展，尤其适用于筛选与特殊发病基理相关的多靶点结合配体。
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