摘要
目的： 糖尿病肾病(DN)是由糖尿病(DM)患者高血糖引发的一种微血管病变，是DM最严重的并发症之一。随着对DN研究的不断深入，人们发现炎症在DN的发生和发展中起着至关重要的作用。CXCL8与其趋化因子受体(CXCR1/2)结合，招募中性粒细胞浸润，进而引发炎症反应。CXCL8(3-72) K11R/G31P(以下简称G31P)，作为CXCR1/2受体拮抗剂，可与CXCL8竞争性结合CXCR1/2受体，从而抑制 CXCL8的生物学活性，发挥其抗炎作用。本实验通过建立 DM小鼠模型，来探讨G31P对DN肾损伤的抑制作用。 方法： 1体内实验 1.1建立DM小鼠模型并分组：实验选取6周龄的C57BL/6J雄性小鼠，通过高脂饮食(HFD)联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法，建立DM小鼠模型。根据研究内容将实验分成以下四组：正常对照组(以下简称Cntl组)、Cntl+G31P组、DM组和DM+G31P组。其中，Cntl+G31P组和DM+G31P组给予小鼠皮下注射G31P，剂量为0.5 mg/kg，两天一次，而Cntl组和DM组注射相同体积的生理盐水，治疗周期为1个月。 1.2动物组织样本采集：治疗期间，每周监测各组小鼠的体重、进食量、饮水量、尿量和血糖等变化情况。治疗一个月后，处死全部小鼠，采集和处理小鼠标本：小鼠眼球取血，室温静置1 h后，离心取血清，-80℃分装保存。剥离小鼠体内双侧肾脏组织，称重并拍照。 1.3实验检测：部分肾脏组织用4%多聚甲醛溶液固定，行H&E、过碘酸雪夫(PAS)、天狼猩红(Sirius red)和免疫组织化学(IHC)等染色：H&E染色观察肾脏组织病理结构，PAS染色观察肾小球硬化程度，Sirius red染色观察胶原沉积情况，IHC检测肾脏组织中Collagen IV、MPO、F4/80、p-NF-kB、CXCR1、CXCR2、Podocin和Nephrin的表达情况；部分肾脏组织用3%戊二醛和1%四氧化锇双重固定，电镜(TEM)观察肾脏组织肾小球基底膜厚度(GBM)厚度和足突融合情况；其余肾脏组织用于提取RNA和蛋白，RT-PCR检测炎症及纤维化相关因子的表达情况，Western blotting检测信号通路中ERK1/2、JAK2和STAT3磷酸化蛋白的表达水平等。 2体外实验： 2.1细胞的培养及分组：体外培养人肾小球系膜细胞(HRMCs)，将6-15代HRMCs分成以下四组：(a)正常血糖组(NG组)，细胞用DMEM培养基培养；(b)甘露醇组(MC组)，细胞DMEM培养基中加24.4 mM的甘露醇做高渗对照；(c)高糖组(HG组)，细胞DMEM培养基中加24.5 mM的葡萄糖刺激；(d) G31P治疗组(HG+G31P组)，细胞在高糖刺激前1 h加100 ng/ml的G31P预处理。 2.2实验检测：用CCK-8实验检测G31P对HRMCs的细胞毒性作用；RT-PCR检测各组细胞中CXCL8、TNF-a、TGF-β和CTGF的表达水平；Western blotting检测各组HRMCs信号通路中ERK1/2、JAK2和STAT3磷酸化蛋白的表达水平。 结果： 1体内实验 1.1 G31P对DM小鼠肾脏具有保护作用：观察肾脏大小并计算肾脏/体重比值发现，G31P治疗可改善DM引起的肾脏肥大症状，肾脏/体重比值降低(P<0.01)；DM小鼠的血糖、进食量、饮水量和尿量均显著升高，G31P治疗后DM小鼠的饮水量和尿量显著减少(P<0.01)；G31P治疗可显著降低DM小鼠的BUN、Ccr和UACR水平(P<0.01)；H&E染色观察发现，DM组小鼠肾小球肥大，系膜基质增多，部分肾小管上皮细胞肥大、空泡变性、萎缩及坏死。G31P治疗后肾小管和肾小球损伤减轻。TEM观察发现，DM组小鼠基底膜呈现不同程度弥漫性增厚，足突增宽、融合甚至消失，足突细胞数量减少，G31P治疗后肾脏组织病理改变得到明显缓解；RT-PCR和IHC实验结果均表明，与Cntl组相比，DM组肾脏Nephrin和Podocin表达水平显著下降，G31P部分恢复二者表达水平(P<0.05)。 1.2 G31P抑制DM小鼠肾脏组织炎症反应：RT-PCR检测发现，DM组小鼠IL-1β、IL-6和 TNF-α表达量显著增加，G31P治疗可显著降低三者表达水平(P<0.01)；IHC染色观察发现，NF-κB、MPO和F4/80在DM组小鼠的肾脏组织中表达显著增高，G31P治疗后三者表达水平显著降低(P<0.01)；ELISA、RT-PCR和IHC等实验结果表明，CXCL8、CXCR1和CXCR2在DM组小鼠血清或肾脏组织中表达显著上升，G31P治疗后三者水平均有不同程度的下降(P<0.05、P<0.01)；Western blotting结果显示，ERK1/2、JAK2和STAT3的磷酸化蛋白水平在DM组表达显著升高，G31P治疗后三者表达量显著下降(P<0.05、P<0.01)。 1.3 G31P改善DM小鼠肾脏组织的纤维化：PAS染色结果显示，DM小鼠肾脏组织内PAS阳性染色物质明显增多，肾小球硬化指数(GSI)升高，G31P治疗后，GSI水平明显降低(P<0.01)；Sirius red染色观察发现，G31P治疗可显著改善DM小鼠肾脏组织内的胶原沉积情况(P<0.01)；IHC检测发现，DM小鼠Collagen IV表达水平比Cntl组明显升高，G31P治疗后，其表达水平明显下降(P<0.05)；RT-PCR和Western blotting研究结果显示，DM组小鼠肾脏组织高表达TGF-β和CTGF，G31P治疗后二者表达水平显著下降(P<0.05、P<0.01)。 2体外实验 CCK-8实验检测结果显示：适当剂量的G31P对系膜细胞增殖没有影响，表明其没有细胞毒性；RT-PCR检测发现，在HRMCs中，与NG组相比，HG组TNF-α、TGF-β和 CTGF表达量显著升高，G31P治疗显著降低三者 mRNA的表达水平(P<0.05)。另外，在30 mmol/L高糖刺激下，CXCL8的mRNA表达量显著增高，峰值在刺激6 h后出现；高糖刺激可诱导HRMCs中ERK1/2、JAK2和STAT3的磷酸化蛋白表达增高，G31P治疗后三者表达量显著下降(P<0.05、P<0.01)。 结论： (1) DN小鼠肾脏组织中炎性细胞大量聚集，炎症相关因子表达明显升高，推测炎症在DN的发生和发展中起到非常重要的作用。 (2)通过与CXCR1/2受体结合，G31P能够减轻DN小鼠的肾脏组织损伤，减少促炎和促纤维化因子的表达，发挥其肾脏保护作用，为临床上治疗 DN提供新的思路和理论基础。
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