摘要
目的: 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的主要病理表现为过多的胆固醇积聚在血管壁，导致斑块形成。脂质代谢紊乱与高脂血症是其主要危险因素。炎症对脂质代谢的影响在AS的发生发展中起着重要作用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）为革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，是诱导炎症反应的常用刺激物。目前，阿托伐他汀是高脂血症和冠心病等动脉粥样硬化性心血管疾病(arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的一线临床治疗药物。除强效降脂作用外，近年大量研究表明阿托伐他汀还具有显著的抗炎效应。因此本研究旨在探讨阿托伐他汀对LPS诱导的细胞及小鼠炎症模型中脂质代谢和胆固醇流出的影响及其作用机制。 方法: 1. RAW264.7细胞实验 (1)以不同浓度LPS(0，10，50，100ng/mL)处理RAW264.7细胞不同时间(0，6，12，24，48h)。Real-time PCR检测不同浓度LPS刺激后，细胞内abca1、abcg1、sr-b1、pcsk9和ldlr在mRNA水平上的表达。Western blot检测不同浓度或不同时间LPS作用后，ACBA1、ABCG1、SR-B1、PCSK9和LDLR在蛋白水平上的表达。 (2)以不同浓度阿托伐他汀(0，1，5，10，25μM)处理2h后，加入LPS(50ng/mL)共同作用24h。Western blot检测细胞ABCA1、ABCG1、SR-B1、PCSK9和LDLR蛋白表达。BODIPY-Cholesterol荧光探针结合激光共聚焦显微镜观察细胞中胆固醇聚集情况。 (3)PPAR-γ抑制剂T0070907(40μM)作用细胞2h，加入阿托伐他汀(0，1，5，10μM)2h，50ng/mL LPS共同作用24h，Western blot检测LDLR蛋白表达。 2. HepG2细胞实验 (1)不同浓度LPS(0，200，500，1000，1500ng/mL)作用HepG2细胞不同时间(0，6，12，24，48h)。Real-time PCR检测不同浓度LPS刺激后，细胞内PPAR-γ、LXR、PCSK9和LDLR的mRNA表达。Western blot检测不同浓度或不同时间LPS作用后，ABCA1、ABCG1、SR-B1、、PCSK9和LDLR蛋白表达。 (2)以不同浓度阿托伐他汀(0，1，5，10，25κM)处理2h后，加入LPS(1000ng/mL)共同作用24h。Western blot检测细胞ABCA1、ABCG1、SR-B1、NF-κB、PCSK9、LDLR蛋白及细胞核蛋白PPAR-γ和LXR表达。 (3)Western blot检测PPAR-γ抑制剂、SREBP2抑带剂、PCSK9抑制剂和PI3K抑制剂对LPS诱导的LDLR及ABCG1蛋白表达的影响。 3. 动物实验 8周龄雄性C57BL/6小鼠7只，8周龄雄性ApoE-/-小鼠35只。普通饲料适应性喂养1周后，ApoE-/-小鼠随机分为5组，每组7只，A1组普通饲料喂养，A2组高脂饲料喂养，A3组高脂饲料加LPS（2.5mg/kg/次）腹腔注射，A4组高脂饲料、LPS（2.5mg/kg次）腹腔注射和10mg/kg/d阿托伐他汀灌胃，A5组组高脂饲料、LPS（2.5mg/kg次）腹腔注射和20mg/kg/d阿托伐他汀灌胃。4周后，每组随机选取2只，自动生化仪检测血脂四项，油红O和HE染色检测小鼠肝脏和主动脉病变情况。其余小鼠持续喂养8周后处死，自动生化仪检测血脂四项，油红O和H.E.染色检测小鼠肝脏和主动脉病变情况。Western检测小鼠肝脏ABCA1、ABCG1、SR-B1、PCSK9和LDLR蛋白表达情况。 结果: 1. RAW264.7细胞实验结果 (1)LPS以浓度及时间依赖性的方式降低ABCA1、ABCG1、SR-B1和LDLR蛋白表达。 (2)阿托伐他汀浓度依赖性的逆转LPS诱导的ABCA1、ABCG1、SR-B1和LDLR蛋白表达降低，显著增加上述蛋白的表达;上调PCSK9蛋白的表达;增加胆固醇流出，减少细胞内胆固醇聚集。 (3)阿托伐他汀上调LDLR蛋白表达的作用可被PPAR-γ抑制剂所阻断，提示PPAR-γ信号通路参与其中。 2. HepG2细胞实验结果 (1)LPS以浓度及时间依赖性的方式降低ABCG1和SR-B1蛋白表达，升高ABCA1、PCSK9和LDLR蛋白表达。 (2)阿托伐他汀能够浓度依赖性的上调LPS诱导的ABCG1和SR-B1蛋白表达降低，下调LPS诱导的ABCA1和NF-κB蛋白表达升高，进一步上调LPS诱导的PCSK9和LDLR蛋白的升高。HepG2细胞核蛋白结果显示，LPS刺激升高PPAR-γ和LXR蛋白表达，阿托伐他汀预处理能进一步升高其表达。 (3)SREBP2、PPAR-γ、PI3K和PCSK9抑制剂能够抑制LPS诱导的LDLR蛋白升高和ABCG1蛋白降低。 3. 动物实验结果 8周后ApoE-/-小鼠血脂指标和病理学改变显著，结果如下： (1)各组ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇、LDL-C和HDL-C水平均显著高于野生对照组(P＜0.001);与LPS模型组比较，高剂量阿托伐他汀治疗组(20mg/kg/d)血清总胆固醇、LDL-C和HDL-C水平显著降低(P＜0.05)。 (2)油红O和HE染色结果显示：与野生对照组比较，肝脏脂肪化和主动脉斑块病变最严重，阿托伐他汀治疗能够减轻病变程度。 (3)Western blot结果显示：与野生对照组比较，LPS刺激能够增加ApoE-/-小鼠肝脏ABCA1、ABCG1和SR-B1蛋白的表达，阿托伐他汀治疗能够抑制其升高;LPS刺激能够降低ApoE-/-小鼠肝脏LDLR蛋白表达，阿托伐他汀治疗使其进一步降低。 结论： 阿托伐他汀干预能够改善LPS引起的脂代谢相关蛋白异常表达并增强胆固醇流出;PPAR-γ、PI3K、PCSK9和SREBP2信号通路可能参与了上述脂代谢调节过程。
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