摘要
昆虫海藻糖酶在昆虫生长发育，飞行能量供给，几丁质合成的调节以及机体抗逆性等方面具有重要的作用。Treh1B基因是从全基因组水平对家蚕、红带袖蝶、君主斑蝶等多个鳞翅目昆虫的海藻糖酶基因进行分析新发现的海藻糖酶基因。以鳞翅目昆虫模式生物家蚕为研究对象，通过进化分析和共线性分析发现，它是通过Treh1A基因复制产生，这两个基因序列相似，结构相似，相邻串联在家蚕17号染色体上。两个基因分别编码一条578个和579个氨基酸多肽，两条多肽有49％的相似度。 本课题主要包括以下5部分的研究: 1、首先通过序列分析对鳞翅目昆虫海藻糖酶的进化和功能分歧进行了分析，结果显示Treh1基因只有在鳞翅目昆虫中发生了复制，产生了Treh1B基因，而且复制基因发生功能分歧，有趣的是鳞翅目昆虫中还存在两种不同的Treh1B。 2、以鳞翅目昆虫模式生物家蚕为研究对象研究Treh1B，即BmTreh1B，首先研究了它的mRNA和蛋白质表达谱，结果显示在幼虫期表达量低，在蛹期和成虫期表达量高，而且在成虫中的前后翅，腿和触角中表达量相对较高。 3、在BmN家蚕卵巢细胞中分别对BmTreh1A，BmTreh1B和BmTreh2进行亚细胞定位，结果显示，BmTreh1A定位在细胞质中;BmTreh2定位在核膜和细胞器膜上;而BmTreh1B定位在细胞器中，推测是溶酶体中。 4、用杆状病毒表达系统表达并用镍柱纯化了BmTreh1A，BmTreh1B，BmTreh2，TvTreh1B和short BmTreh1B重组蛋白，然后用纯化的重组蛋白分别测定了它们的酶动力学性质，如底物特异性，最适pH，抑制剂，Km和Vmax值。结果显示，BmTreh1A，BmTreh1B，BmTreh2特异性水解海藻糖，最适pH均为酸性，但BmTreh1B的耐酸性更强，最适pH为5，BmTreh1A和BmTreh2最适pH为6，井冈霉素对三个海藻糖酶的抑制效果显著，而α-葡萄糖苷抑制剂的抑制效果不显著;与BmTreh1A和BmTreh2相比，BmTreh1B的Km值较大。而TvTreh1B和相应截短的BmTreh1B却没有酶活性。 5、用CRIPRS/Cas9技术获得了三种纯合Bm Treh1B突变体基因型，并进行了表型的初步分析，结果发现BmTreh1B基因的缺失导致了家蚕各个时期个体偏小和成虫翅膀的畸形，说明BmTreh1B可能调控翅膀的发育。 综上所述，在鳞翅目昆虫中新发现了一个海藻糖酶Treh1B基因，本课题研究Bm Treh1B基因发现它在时空表达和亚细胞定位以及酶动力学性质都存在差异，而且突变体表型初步分析发现会导致翅膀畸形。该研究结果为今后进一步深入研究Treh1B的功能和作用机制奠定了重要的基础。
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