摘要
研究目的: 急性髓细胞白血病(AML)是常见的血液系统恶性肿瘤，预后差，易复发或演变为难治性AML，耐药是AML复发及难治的重要原因。近年研究发现肿瘤的耐药与表观遗传学的调节有关，西达本胺(CS055)是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，研究发现CS055能通过抑制HDAC以增加组蛋白的乙酰化、降低组蛋白甲基化水平来引发染色质重塑，由此改变多条信号传递通路，进而恢复耐药细胞对药物的敏感性。本课题组前期研究发现，AML细胞株Kasumi-1对阿霉素(ADM)及阿糖胞苷耐药，同时证实了沉默EZH2后通过抑制Hedgehog通路体活性外能增加Kasumi-1细胞对化疗药物的敏感性。 本实验旨在探讨CS055体内外是否能增加Kasumi-1细胞对化疗药物的敏感性，同时研究其逆转耐药机制。 研究方法: 1.CS055对急性白血病细胞株Kasumi-1增殖及凋亡影响:用CCK-8(cellcounting kit-8)法测不同浓度的CS055作用不同时间对Kasumi-1细胞增殖活性的影响。流式细胞术测不同浓度的CS055处理Kasumi-1细胞48h凋亡情况。 2.CS055增加急性白血病细胞株Kasumi-1对化疗药物的敏感性:CCK-8法检测ADM及CS055联合ADM作用24h后对Kasumi-1细胞增殖活性的影响，并计算出逆转耐药倍数。流式细胞术测CS055、ADM单药及联合用药处理Kasumi-1细胞24h凋亡情况。 3.CS055下调EZH2/Hedgehog通路:用Western blot检测CS055作用Kasumi-1细胞48h后EZH2、G1i-1、Smo、DNMT3A、Acetyl-H3、H3K27me3等蛋白的表达变化。 4.CS055对裸鼠移植瘤化疗增敏作用:培养Kasumi-1、Si-EZH2 Kasumi-1细胞，以1×107个细胞/只接种于6周龄BALB/c裸鼠皮下，瘤体大小约150-200mm3，将Kasumi-1细胞的荷瘤裸鼠随机分4组:空白对照组、ADM组、CS055组、CS055联合ADM组，Si-EZH2 Kasumi-1细胞的荷瘤裸鼠分为空白对照组、ADM组。每日测量裸鼠肿瘤长短径并计算肿瘤体积。第10天处死荷瘤鼠，手术摘除肿瘤称重，免疫组化研究信号蛋白表达水平。 5.免疫组化观察裸鼠移植瘤通路信号蛋白表达:将肿瘤组织石蜡切片，免疫组化观察各组EZH2、Gli-1、Smo、p-AKT、MRP1表达水平。 6.统计分析:采用SPSS20.0软件进行数据分析，两组均数比较采用t检验或非参数检验，多组均数比较用单因素方差分析或非参数检验，多重比较分析若方差齐则采用Bonferroni方法，方差不齐则使用近似F检验分析后采用Dunnett's T3方法， P＜0.05认为差异有统计学意义。 研究结果: 1.CS055对Kasumi-1细胞增殖、凋亡的影响 细胞增殖实验结果显示，不同浓度CS055对Kasumi-1细胞具有生长抑制作用，随处理时间延长和药物剂量增加，细胞增殖抑制率提高，呈明显的时间一剂量依赖关系。与之相应，细胞总凋亡率随着药物浓度的增加也逐渐增加，单因素方差分析显示，不同药物浓度处理Kasumi-1细胞48h细胞总凋亡率之间存在统计学差异(F=88.09; P=0.000)。 2.CS055逆转Kasumi-1细胞的耐药作用 CCK8法检测结果显示，CS055能够提高ADM对Kasumi-1细胞的增殖抑制作用，联合组IC50浓度为0.301±0.082μg/ml，明显低于ADM单药组（2.421±0.045μg/ml），其逆转耐药倍数为8.1倍。凋亡结果显示， CS055明显提高ADM对Kasumi-1细胞的凋亡率，其总凋亡率43％，明显高于空白组、CS055组和ADM组(P=0.000)。 3.CS055下调EZH2/Hedgehog通路活性 CS055处理Kasumi-1细胞48 h，Western blot结果显示Acetyl-H3表达量明显升高，而EZH2及EZH2调节蛋白DNMT3A、H3K27me3表达下降，同时伴随其下游Hedgehog相关蛋白Smo、Gli-1表达水平明显降低。 4.移植瘤瘤体变化 体内实验结果表明，Kasumi-1 CS055组、Si-EZH2 Kasumi-1 ADM组、Kasumi-1 CS055联合ADM组肿瘤细胞生长速度及瘤体重量明显低于Kasumi-1Control组、Kasumi-1 ADM组及Si-EZH2 Kasumi-1 Control(P＜0.001)，同时Kasumi-1 CS055联合ADM组肿瘤生长速度及瘤重低于Kasumi-1 CS055组(P＜0.05)。 5.免疫组化检测每组肿瘤组织各蛋白信号表达: 结果显示CS055处理后，组织中EZH2、Smo、Gli-1、p-AKT、MRP1表达下降，同时沉默EZH2后Smo、Gli-1、p-AKT、MRP1蛋白表达量也明显下降。 研究结论: 1.CS055对Kasumi-1细胞具有显著的增殖抑制作用及诱导细胞凋亡作用，且呈时间-剂量依赖性。 2.CS055能够增加ADM对Kasumi-1细胞的增殖抑制作用及凋亡作用。 3.CS055能可能通过降低Kasumi-1细胞的EZH2表达，从而抑制组蛋白甲基化及DNA甲基化，进而下调Hedgehog信号通路及其下游p-Akt/MRP1表达来逆转Kasumi-1细胞对化疗药物的抵抗。
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