摘要
天然产物中存在多种丰度很低的小分子蛋白，为维持生命体的正常运行发挥重要作用。固定化金属亲和层析法因其特异性吸附功能而备受青睐，但杂蛋白会与目标小分子竞争亲和介质的吸附位点，降低亲和分离的选择性。为削弱杂蛋白对吸附位点的竞争，本课题使用二醇基修饰固定化金属亲和介质，以更好地排阻杂蛋白，增强吸附活性小分子。为避免因载体均一度不佳而影响应用，本课题采用膜乳化-原位法制备出均匀的亲和载体。 结果如下: (1)以膜乳化法制备壳聚糖微球，在乙酸含量3％、乳化剂含量4％、乳化压力200kPa、转速400 r·min-1、交联剂2mL及固化溶液pH值为7.5的条件下，可得到平均粒径为5.95μm，粒径分布系数为0.37的壳聚糖微球。再结合原位法，当壳聚糖与FeCl2·4H2O的质量比为1∶1时，可得到磁饱和强度为25.69 emu·g-1的均匀磁性壳聚糖微球(M-CS)。 (2)用环氧氯丙烷(ECH)来活化载体(M-CS)，在45℃、ECH体积分数为50％、NaOH浓度为0.6 mol·L-1及反应6h的条件下，所得环氧基密度最高，为189.72μmol·g-1。再以IDA为螯合剂，制备出磁性固定化Cu2+亲和介质(M-CS@Cu2+)，并优化该介质吸附牛血清蛋白(BSA)的条件:当BSA浓度为1.0mg·mL-1时，在0.01 mol·L-1的PBS缓冲液pH为6.8，35℃吸附1.5h的条件下，M-CS@Cu2+对BSA的吸附量最大，为123.27mg·g-1。同时发现可用Freundlich方程来描述M-CS@Cu2+对BSA的吸附，且该吸附符合伪二级动力学模型。 (3)通过控制IDA的用量来分配环氧基的反应路径，在M-CS@Cu2+的基础上制备出二醇基修饰的亲和介质(M-CS@Cu2+@OH)。以VSLPEW为活性小分子模型，BSA为大分子蛋白模型，比较M-CS、M-CS@Cu2+和M-CS@Cu2+@OH对BSA与VSLPEW的混合体系的吸附，发现M-CS@Cu2+@OH存在更好的特异性吸附效果，可把VSLPEW的含量由0.99％富集到4.66％。用pH为5.0，2.0 mol·L-1的NaCl溶液洗脱介质三次，每次25min，且介质在重复使用三次后效果变差，再生后吸附能力基本稳定。以酪蛋白酶解液来模拟实际体系，通过比较M-CS、M-CS@Cu2+和M-CS@Cu2+@OH对酶解液的吸附及活性检测，发现被M-CS@Cu2+@OH吸附的蛋白具有更高的活性。
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