摘要
NADH氧化酶(NADH Oxidase，EC1.6.99.3，简写为NOX)是一种氧化还原酶类，直接将NADH氧化为NAD+。它可以与以NAD+为辅酶的氧化还原酶偶联，再生成NADH。国外研究发现，很多微生物细胞中存在NADH氧化酶，它在辅酶再生和调控微生物代谢方面有重要作用。 本论文以酿酒酵母BY4741为出发菌株，通过代谢分析、(qRT)-PCR分析以及RNA-seq分析等手段研究了好氧体系下，表达NADH氧化酶对酿酒酵母糖代谢和耐高渗能力的影响;通过代谢分析与(qRT)-PCR分析的手段研究了NADH氧化酶在厌氧条件下的活性;最后通过在丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）中表达该NADH氧化酶以考察该酶在厌氧条件下调控作用的普适性。具体研究内容如下: 1.构建酿酒酵母NADH氧化酶表达菌株(Sec-NOX)和对照菌株(Sec-CON)，对Sec-CON和Sec-NOX进行好氧发酵。实验结果表明，Sec-NOX菌株中葡萄糖消耗速率和细胞生长速率加快，发酵周期缩短，同时乙醇量增加，甘油量减少。 2.选取对数生长期初期、中期、末期的Sec-CON和Sec-NOX细胞进行RNA-seq分析，对不同阶段的差异表达基因进行统计和分析。数据显示，和Sec-CON相比，Sec-NOX中己糖转运子HXT6基因、硫胺素合成相关的THI基因以及全局转录因子AP4的表达上调，这与好氧发酵中葡萄耱消耗速率加快的结果相一致;同时，转录组数据和不同浓度NaCl平板实验验证了表达NADH氧化酶可以提高酵母抵御渗透压胁迫的能力。通过(qRT)-PCR分析的手段进一步验证转录组分析的结果。 3.比较Sce-CON和Sce-NOX在厌氧条件下的发酵性能。和好氧发酵的结果一样，Sce-NOX菌株中葡萄糖消耗速率和细胞生长速率加快，发酵周期缩短，同时乙醇量增加，甘油量减少，并通过(qRT)-PCR分析的手段验证相关基因的表达情况。 4.构建丙酮丁醇梭菌NADH氧化酶表达菌株(Cac-NOX)和对照菌株(Cac-CON)。对Cac-CON和Cac-NOX进行厌氧发酵，相比Cac-CON，Cac-NOX的葡萄糖消耗速率、细胞生长速率和ABE产量降低，而乙酸和丁酸积累增加，并通过qRT-PCR验证了发酵结果。表达NADH氧化酶后丙酮丁醇梭菌的生长受到了严重的抑制，但这一现象证明了NADH氧化酶能在厌氧体系中发挥氧化作用具有普适性。
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