摘要
葡萄是我国栽培最广泛的水果之一，2010年我国葡萄总产量居世界第一位，与葡萄产业的发展伴随的是葡萄病害的发生和危害。白腐病是由真菌引起的病害，是危害葡萄的四大病害之一，它对葡萄会有致命的影响，如何提高葡萄对白腐病的抗性是亟待解决的问题。中国野生葡萄具有丰富的抗性，在抗寒、抗旱、抗病以及在抗湿热能力方面都具有较强抗性。本研究以中国野生葡萄为研究对象，旨在挖掘葡萄抗白腐病的抗性资源，克隆其抗性基因。 首先，采用田间调查结合田间人工接种鉴定的方法对葡萄资源圃内的中国野生葡萄抗白腐病性状进行了系统的评价。田间调查发现，中国葡萄野生种的果实在自然发病条件下不感白腐病。在人工接种条件下，野生葡萄却表现出种间与种内的抗性差异，调查发现，塘尾葡萄与山葡萄表现出高抗白腐病性状，而燕山葡萄与湖南刺葡萄则表现出高感白腐病性状。调查还发现在同一种内也存在着抗病和感病两种类型。 其次，在调查的基础上，选用抗白腐病的刺葡萄作为研究材料，采用同源克隆的方法，来获取葡萄抗白腐病的抗病基因同源序列（RGA），并通过荧光定量 PCR分析这些基因与白腐病之间的关系。根据 NBS-LRR类抗病基因的保守区域设计引物，提取抗病材料的DNA与RNA，经PCR扩增及筛选得到了10个RGAs，这10条 RGA编码的氨基酸序列均含有 NBS的4个保守结构域，即 P-loop（GGVGKTT）、Kinase-2a（VLDDVW/D）、Kinase-3a（GSR/KILVTTR）和HD（GLPLAL）。这10条抗病基因同源序列，6条分离自基因组DNA（NB-1、NB-3、NB-5、NB-7、NB-11和NB-12），4条分离自cDNA（NBS-6、NBS-4、NBS-13和NBS-16）。10条葡萄抗病基因同源序列所编码的氨基酸，同4个已知 R基因氨基酸序列的同源性在20.8%-46.2%之间，NB7基因同拟南芥抗丁香假单孢杆菌基因RPS5之间的同源性为46.2%。而且，10条葡萄抗病基因同源序列在氨基酸水平上的同源性表现出丰富的多态性，同源性分布在23.5%-98.8%之间。进一步分析发现这10个 RGAs中4个属于 non-TIR-NBS-LRR类抗病基因，6个属于 TIR-NBS-LRR类抗病基因。经过 NCBI比对，RGAs和葡萄上已经定位在葡萄染色体5号、9号、13号、18号和19号的假定抗病蛋白 mRNA高度同源。荧光定量PCR分析表明NB7基因受到葡萄白腐菌的诱导，说明NB7基因可能为潜在的葡萄上的抗白腐病基因，为最终克隆葡萄抗白腐病基因奠定了基础，其确切的功能还需进行进一步的研究分析。 通过研究得到主要结论，我国葡萄野生种的果实在自然发病条件下不感白腐病，在人工接种条件下，野生葡萄表现出种间与种内的抗性差异。运用分子手法进行研究，从抗病材料刺葡萄上得到了10个抗病基因同源序列，其中NB7基因受到葡萄白腐菌的诱导，这为获得抗白腐病基因提供了理论依据。
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