摘要
苦荞（Fagopyrum tataricum）是一种食药两用的小杂粮，因富含黄酮等生物活性成分，已成为重要的功能性食品原料开发。苦荞芽菜，作为一种新型的保健食材，由于富含花青素而备受青睐，特别是受到素食主义者的追捧。适当食用花青素可降低人患心肌梗死的概率，还具有预防心脑血管疾病和促进视红素再合成等功效。因此，提高花青素含量是改善苦荞芽菜的品质和经济价值的关键，分离鉴定其花青素合成关键酶基因具有重要理论意义和应用价值。类黄酮3-O-糖基转移酶(UFGT)是花青素合成途径的关键酶，该酶催化的糖基化修饰可改变花青素的溶解度、稳定性和颜色，糖基化产物在植物多种生理生化过程中也扮演了重要作用。本研究以“西荞2号”苦荞为材料，通过克隆花青素合成途径关键酶基因UFGTs，对其编码蛋白的结构、功能和在冷胁迫下的表达特征进行了研究，加深了对苦荞花青素合成的分子机理的认识，也为人工栽培高花青素苦荞芽菜提供了理论依据。主要研究结果如下: 1.以苦荞花总RNA为材料，根据苦荞花期转录组数据，采用RT-PCR技术克隆了3个苦荞UFGT蛋白基因，命名为FtUFGT1、FtUFGT2和FtUFGT3。序列分析表明，FtUFGT1的ORF长1341 bp，编码446个氨基酸。FtUFGT2的ORF长1500 bp，编码499个氨基酸。FtUFGT3的ORF长1413 bp，编码个470氨基酸。分子对接分析显示，FtUFGT1-3均能与矢车菊素成功对接，其C-和N-结构域的活性残基分别负责供体UDP-葡萄糖和受体矢车菊素的识别。系统发育树分析表明，FtUFGT1-3均属于UF3GT家族。 2.花期苦荞花青素含量测定结果表明，花青素主要分布于花中，其次为叶和根，茎中含量最低。qPCR分析结果表明，FtUFGT1、FtUFGT2和FtUFGT3的表达模式具有组织特异性，三者在根、茎、叶和花中均有表达，且均在花中的表达量最高。FtUFGT3基因在不同组织部位的表达水平均要高于FtUFGT1和FtUFGT2基因，可能为苦荞花青素糖基化的主效基因。 3.采用荧光定量PCR和分光光度技术，测定了冷胁迫下芽期苦荞FtUFGT1-3基因表达和花青素合成。结果表明，在冷胁迫下，芽期苦荞FtUFGT1-3基因的表达均呈上升趋势，FtUFGT3具有最高的表达水平，其次为FtUFGT2，而FtUFGT3表达量最低。在冷胁迫下，芽期苦荞花青素含量迅速上升，处理6h后达到最大值，较处理前增加了2.3倍，并在处理12 h-24h趋于稳定。 4.分别将所得FtUFGT1-3的ORF序列构建于原核表达载体pGEX4T-1，转入大肠杆菌表达。经0.2 mM IPTG，25℃条件下诱导10h后收集菌液，SDS-PAGE电泳分析。结果表明，重组FtUFGT1、FtUFGT2和FtUFGT3的GST融合蛋白均为可溶性表达，分子量分别为74 kDa、80 kDa和76 kDa。 5.重组蛋白经GST亲和层析纯化后，使用凝血酶切除GST标签，获得高纯度的FtUFGT1、FtUFGT2和FtUFGT3蛋白。利用HPLC-MS/MS对FtUFGT1-3进行体外酶活鉴定。结果显示，反应产物中有矢车菊素3-O-葡萄糖苷生成，表明FtUFGT1、FtUFGT2和FtUFGT3蛋白都具有糖基转移酶的催化活性。
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