摘要
甜味蛋白monellin（莫内林）由于自身具有高甜味（约为蔗糖的3000倍）和低卡路里的特点，因此在食品应用方面有较强的潜在价值。但是天然状态下甜味蛋白monellin的耐热稳定性及耐酸碱稳定性较弱，使得monellin在食品应用方面受到了极大的限制。 本研究中，我们首先根据甜味蛋白monellin的氨基酸序列(GenBank:AFF58925.1)，结合细菌密码子的偏好性，人工设计合成单链monellin基因，构建重组质粒并将其导入到大肠杆菌内进行表达，然后通过镍亲和层析以及分子筛层析分离纯化获得较纯蛋白收集液。纯化后的蛋白液进行透析实验，然后通过相关实验对其甜味阈值及热稳定进行研究。进一步利用凝血酶对表达蛋白进行酶切实验，验证组氨酸标签并不会对甜味蛋白产生影响。 我们针对甜味蛋白monellin热稳定性较低这一特性，通过序列和结构分析及基因突变的手段改变蛋白上不同位点的氨基酸，实现蛋白热稳性提高且甜度不会下降的目的。在这些突变中效果最为显著的为突变体E23A和C41A，前者是保持甜味阈值不升高且热稳定性相较于单链甜味蛋白monellin显著提高，可在85℃温度下保持30min不变性，后者则是热稳定性有较小的提升，且甜味阈值降低，比野生型甜味蛋白monellin甜度还要高。此外，我们还发现能够提高蛋白热稳定性的突变体的氨基酸位点分布于α-螺旋的两端。经过本研究，我们证明可以通过基因突变手段来提高甜味蛋白monellin的稳定性，实现甜味蛋白monellin的工业化生产，为人类提供了一种新型糖类替代品。
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