摘要
仿刺参[Apostichopus japonicus,(Selenka，1867)]是我国海洋重要养殖经济动物，长期以来我国仿刺参养殖产业一直在北方地区开展，但目前仿刺参的人工养殖出现南移趋势，随着南方养殖规模的逐年扩大，养殖管理的不规范，导致仿刺参爆发病害，其中，腐皮综合征是目前南方仿刺参养殖过程中最常见的疾病。南方夏季水温高，仿刺参免疫力下降，此时最易发病，在病害爆发时可导致大规模个体死亡，严重威胁着我国南方仿刺参养殖产业。 本研究致力于明确南移养殖度夏仿刺参腐皮综合征的病原菌，建立病原菌的快速鉴别技术;同时结合分子生物学技术研究腐皮综合征病原菌入侵仿刺参时的免疫防御机制，特别是分离腐皮综合征病原菌诱导下的差异表达基因，了解其表达模式，探讨腐皮综合征病原菌的诱导和免疫相关基因的关系，为克隆免疫相关基因创造条件，深入阐述仿刺参的免疫防御机制和培育抗病新品种奠定基础。 主要结果如下: 1.从患有腐皮综合征的度夏仿刺参上分离纯化获优势菌株，人工回接感染实验验证其为病原菌。利用注射感染和浸浴感染两种方式了解该病原菌对仿刺参的致病性，发现两种方式均能诱导发病，从而证明了本实验分离的菌株对仿刺参具有较强致病性。综合采用3种方法全面了解病原菌的特征并加以鉴定，确定该病原菌为伯麦罗弧菌(Vibrio pomeroyi Thompson et al，2003)。研究表明，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术准确、便捷、重复性高，非常适合于传统鉴定方法易混淆的弧菌种类鉴别，可作为病原菌快速鉴别的方法。 2.将本次实验获得的伯麦罗弧菌菌株V.pomeroyi SUS与分离自巴西海域的V.pomeroyi LMG20537T（典型菌株）以及分离自彼得大帝湾的V.pomeroyi929进行比较，结果表明来自不同海域的菌株对盐度和温度的耐受性与其生长的环境密切相关，表现出不同海域间的明显差异，其中采自夏季福建海域的V.pomeroyi SUS相对其他2个菌株对高温具有较好的耐受性;来自于巴西圣卡塔琳娜州盐度较高海域的的典型菌株V.pomeroyiLMG20537T与另2株采集自盐度相对较低海域（福建莆田、彼得大帝湾）的菌株相比，对盐度具有较高的耐受性，能在含8％NaCl培养基上生长。 3.采用抑制性消减杂交技术，以仿刺参体内承担主要免疫作用的体腔细胞为材料，构建了仿刺参经伯麦罗弧菌诱导的抑制性差减杂交cDNA文库。文库中的808个阳性克隆提取质粒后测序，共得到806条高质量序列，聚类后共获得318个unigene。对基因进行GO分类，发现GO分类为生物过程的unigene数量最多，细胞组分和分子功能的unigene数量比较持平。在细胞组分注释类别下，以细胞组成(cell part)最多;在分子功能类中蛋白质结合功能(protein binding)最多;而在生物过程中，生物学调节过程(regulation of biological process)是包含差异基因最多的类别。 4.据生物信息学分析结果，筛选出C型凝集素（contig116和contig17）、含铁蛋白（B07和H01）和血清样淀粉蛋白A(contig96)5个与免疫相关的ESTs。利用荧光实时定量PCR技术研究仿刺参5个ESTs在伯麦罗弧菌诱导下的差异表达，结果表明:C型凝集素由于种类不同，在病原菌诱导后在体腔细胞中随时间推移其表达量的变化模式不同;但在病原菌诱导后24h，两者在不同组织/器官中的表达分布模式比较一致，均在体腔细胞中表达量最高，体壁组织中表达量最低，contig17在体壁组织中甚至没有表达。血清淀粉样蛋白A在病原菌诱导后24h出现上调，48h转而下降，根据该蛋白的特性，我们可推断伯麦罗弧菌诱导48h后已不属于仿刺参对病原菌反应的急性期。含铁蛋白包括铁蛋白(B07)和核糖核苷酸还原酶(H01)，前者于病原菌诱导后在呼吸树中的表达量最高;后者则在体腔细胞中表达量最高，呼吸树次之。两者在病原菌诱导后时间序列上的表达模式也不同，铁蛋白在24h出现下调，而核糖核苷酸还原酶却在24h出现上调。可见含铁蛋白不仅具有氧的运输和电子转运功能，同时也与免疫防御息息相关。
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