摘要
目的: 帕金森病(Parkinson's disease，PD)是常见的神经系统退行性疾病，其病因及发病机制至今尚未完全阐明。流行病学调查表明神经炎症是帕金森病发病的促进因素，而且近年来研究提示辅助性T(T helper,Th)17细胞在外周和中枢诱导的炎症反应促进了PD的发生，而对Th17细胞有拮抗作用的调节性T(regulatory T，Treg)细胞的抗炎作用可以对PD发挥神经保护作用。目前有研究认为对可以通过对炎症反应调控来治疗中枢神经系统的疾病。已有发现雷帕霉素对PD有缓解治疗作用，但机制不明。本实验选用免疫抑制剂三氧化二砷对PD模型小鼠Th17/Treg平衡进行针对性干预治疗，同时对比雷帕霉素的治疗效果，探索三氧化二砷对PD的治疗作用和机制，为帕金森的药物治疗提供新的思路和依据。 方法: 1.模型构建与给药:本实验采用急性MPTP帕金森模型。选取14-15周龄的C57BL/6小鼠100只，随机分为生理盐水治疗组、三氧化二砷治疗组、雷帕霉素治疗组和正常对照组4组，生理盐水治疗组小鼠第1天进行腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methy-4-pheny1-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP),20mg/kg/次，注射4次，间隔2h，之后7天每日注射生理盐水。三氧化二砷治疗组第1天按同样方式注射MPTP，之后7天每日注射三氧化二砷;雷帕霉素治疗组第1天按同样方式注射MPTP，之后7天每日服用雷帕霉素;正常对照组仅注射生理盐水。 2.模型小鼠行为学评价:在末次给药第2天，用转棒仪对模型小鼠进行行为学检测。 3.中脑多巴胺(dopamine，DA)能神经元功能检测:在末次给药第2天，用免疫荧光组织化学染色法对各实验模型小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫化学染色检测。 4.模型小鼠外周环境Th17和Treg细胞检测:在末次给药第2天，运用ELISA进行外周血炎症因子检测。 5.模型小鼠脑内Th17和Treg细胞检测:在末次给药第2天，用实时荧光定量PCR和Western blot方法，检测各组模型小鼠中脑实质中Th17细胞的致炎细胞因子白介素17(interleukin17，IL-17)和特异性转录因子RORγt以及Treg细胞相关转化生长因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)和特异性转录因子Foxp3的表达情况。并通过免疫组化的方法对IL-17进行中脑定位。 结果: 1.三氧化二砷改善了MPTP对PD模型小鼠的行为学改变:三氧化二砷治疗组小鼠转棒实验测试中掉落时间潜伏期明显长于生理盐水组小鼠。 2.三氧化二砷减轻了PD模型小鼠中脑多巴胺能神经元韵损伤:三氧化二砷治疗组小鼠中脑中TH免疫反应阳性神经元的数量较生理盐水治疗组小鼠明显增多。 3.模型小鼠外周血炎症因子检测:与生理盐水治疗组小鼠相比，三氧化二砷治疗组模型小鼠外周血Th17细胞相关致炎细胞因子IL-17表达下调，而Treg细胞相关抗炎因子TGF-β的表达上调;与雷帕霉素治疗组小鼠相比，三氧化二砷治疗组小鼠外周血Th17细胞相关致炎细胞因子IL-17表达没有明显差异，而Treg细胞相关抗炎因子TGF-β的表达上调;与正常对照组小鼠相比，三氧化二砷治疗组小鼠外周血Th17细胞相关致炎细胞因子IL-17和Treg细胞相关抗炎因子TGF-β的表达未见明显差异。 4.模型小鼠脑内Th17和Treg细胞相关因子检测:与生理盐水治疗组相比，三氧化二砷治疗组模型小鼠中脑Th17细胞的特异性转录因子RORγt及致炎细胞因子IL-17的表达下调，同时Treg细胞的特异性转录因子Foxp3及抗炎细胞因子TGF-β的表达上调;与雷帕霉素治疗组相比，三氧化二砷治疗组小鼠中脑RORγt、IL-17和Foxp3检测指标未见明显差异，但Treg细胞相关抗炎细胞因子TGF-β的表达上调。小鼠中脑IL-17的定位检测结果显示三氧化二砷治疗组较生理盐水治疗组增多;与雷帕霉素治疗组和正常对照组没有差异。 结论: 三氧化二砷对MPTP诱导的PD模型小鼠有治疗作用;免疫抑制剂三氧化二砷和雷帕霉素对MPTP诱导模型小鼠治疗作用机制可能是通过对Th17/Treg平衡干预来实现的。
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