摘要
3-羟基丙酸（3-HP）是一种重要的平台化合物，可以被用来合成多种重要的化合物，具有十分广泛的应用前景。近些年伴随着生物柴油工业大量生产，甘油价格日渐下降。若能得到一株可以高效利用甘油催化生产3-HP的菌株，将会产生巨大的环境与经济效益。本论文为了实现利用重组克雷伯氏菌发酵合成3-HP，开展了以下研究。 PCR扩增Cupriavidus necator GabD4和Azospirillum brasilense KGSADH醛脱氢酶基因，分别与获得卡那霉素(Kanamycin)抗性的pUC19质粒(pUC19Kan)连接，导入宿主菌Klebsiella pneumoniae DSM2026。通过摇瓶发酵，比较重组菌KpKan/KGSADH与KpKan/GabD4的发酵性能。结果证明，KpKan/KGSADH和KpKan/GabD4的最高3-HP产量分别为3.66与2.56g/L，最终选择产量较高的KpKan/KGSADH重组菌进行后续研究。 通过摇瓶单因素实验，详细优化重组菌KpKan/KGSADH的底物浓度、酵母膏浓度、初始pH、装液量与接种量等影响因素。获得最优条件为:30g/L甘油、4g/L酵母膏、初始pH7.0、2％接种量、250mL摇瓶装125mL发酵培养基。优化后的3-HP的最高产量为3.81g/L。在此基础上，摇瓶发酵过程中两次调节pH至7.0，3-HP的最高产量可达11.2g/L。 在5L发酵罐中，运用上述优化的培养基配方，以分段调控pH的方式进行发酵，3-HP的产量最高达到11.9g/L;采用实时调控pH的方式进行发酵，3-HP的产量最终到达13.4g/L。最后，在实时调控pH的基础上，分别在发酵12h与40h补充60g甘油，3-HP的产量最终达到本研究最高的15.1g/L。 本论文首次将C.necator GabD4的醛脱氢酶基因导入Klebsiella pneumoniae DSM2026构建重组菌。同时，详细对比了KpKan/KGSADH与KpKan/GabD4的产3-HP性能。通过摇瓶和5L发酵罐的发酵优化，使KpKan/KGSADH的产3-HP水平达到15.1g/L，为初始水平的4倍。通过本研究，为利用Klebsiella pneumoniae重组系统进一步提高3-HP产量奠定基础。
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