摘要
大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位是一种非常有效的粘膜免疫佐剂，它能刺激机体产生强烈的粘膜和系统免疫应答。LTB通过与细胞表面的 GM1结合，不仅能增强机体对抗原的免疫应答效应，还能够改变粘膜免疫应答的类型。LTB的免疫调节作用包括促进 Th1和 Th2型细胞反应的细胞因子的表达，CD8+ T细胞的凋亡和 CD4+ T细胞的增殖；使 B细胞活化的 MHCⅡ、ICAM-1、CD25、CD40分子表达增加，影响 B细胞和巨噬细胞的抗原处理和递呈过程。但在巨噬细胞的具体免疫机制尚不清楚，本文将在这方面进行研究。 目的：从 LTB处理的 RAW264.7细胞中，筛选与 LTB有相互作用的蛋白质分子，并通过生物信息学方法预测其与 LTB佐剂活性的相关性；并利用分子生物学技术对它们的相互作用进行验证，最终探索LTB作为免疫佐剂的分子机理。 方法：(1)在大肠杆菌中诱导表达含 His-tag的 LTB融合蛋白，用镍磁珠纯化。(2)复性后的 LTB融合蛋白去除内毒素，然后处理RAW264.7细胞。(3)提取 LTB处理后 RAW264.7细胞总蛋白，用pull down的方法，分离与 LTB有相互作用的蛋白分子。(4) PAGE检测分离得到的蛋白分子，并收集该蛋白质进行质谱鉴定。(5)运用生物信息软件从质谱鉴定结果中筛选出可能的相互作用蛋白分子，并对其进行功能性分析和信号通路分析，构建出这些蛋白分子相互作用的网络图，筛选出有意义蛋白分子。(6)免疫荧光验证这些分子在细胞内与 LTB相互作用。(7) Western blot检测下游分子的表达。 结果：(1)通过pull down捕获到与LTB有相互作用的蛋白分子，并通过质谱鉴定了这些蛋白分子。(2)通过对这些蛋白分子进行生物学分析后，筛选出 junction plakoglobin、heat shock protein1、carbamoyl-phosphate synthetase1、vimentin等25种有统计学意义的蛋白分子。(3)通过对25种蛋白分子进行功能及其信号通路分析(3)免疫荧光结果显示， Vimentin在生理状态下不能与 LTB相互作用，而GM130在细胞内与LTB有相互作用，表明LTB在细胞内是以内吞小泡的形式运输的。(4) Western blot检测显示， LTB处理RAW264.7细胞12 h后，β-actin表达上调，Hspd1表达无变化，表明LTB与Actb确实存在相互作用。 结论：通过质谱鉴定结果和免疫荧光实验，我们可以推测 LTB通过与免疫细胞表面 GM1结合，在Keratin家族和Actb等细胞骨架相关蛋白分子的协助下内吞，并以小泡的形式到达高尔基体，通过高尔基体的加工、转运到Jup处或以抗原的形式直接递呈给T细胞，通过Jup激活 TCF/LEF，促进 T细胞的活化、增殖与分化，以及相关细胞因子的分泌，达到促进免疫应答的作用。
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