摘要
研究目的： 葡萄糖代谢异常是引发代谢相关疾病的重要因素之一。众所周知，规律的有氧运动是防治机体肥胖、胰岛素抵抗(IR)和2型糖尿病(T2DM)的有效手段。机体运动主要是通过骨骼肌收缩和舒张来完成，人体内约80%由胰岛素介导的葡萄糖转运和利用是由骨骼肌组织完成，因此，促进骨骼肌细胞葡萄糖代谢能够增强机体组织对胰岛素的敏感性，改善 IR、预防 T2DM的发生。 II型组蛋白去乙酰化酶(HDACs)作为转录抑制因子对组织细胞葡萄糖代谢起着重要的调节作用，II型组蛋白去乙酰化酶中的 HDAC4和 HDAC5是运动敏感性的组蛋白去乙酰化酶。有氧运动作为预防和治疗肥胖、IR和多种代谢性疾病的有效手段，其作用机理是否与骨骼肌组织 II型 HDACs的调控有关目前尚不完全明了。本研究以 II型 HDACs调控组织细胞葡萄糖代谢为线索、以在体动物模型和离体细胞模型为对象，研究 HDAC4和 HDAC5在有氧运动改善骨骼肌细胞葡萄糖摄取及利用的作用机制。通过在体动物实验和离体细胞培养相结合的方式，研究有氧运动对 C57BL/6小鼠骨骼肌细胞 HDAC4和HDAC5调控葡萄糖转运体4(GLUT4)基因表达相互作用关系的影响；并在离体状态下探讨微小RNA-206(miR-206)调节氧化型骨骼肌细胞 HDAC4基因表达的具体机制，同时本研究还采用一磷酸腺苷活化蛋白激酶α2(AMPKα2)基因敲除小鼠，研究在 AMPKα2缺失的情况下骨骼肌细胞 HDAC4和 HDAC5调控细胞葡萄糖代谢的变化，为进一步揭示 HDAC4和 HDAC5在骨骼肌细胞葡萄糖代谢中的作用机制提供理论依据。 研究方法： 1.动物模型的建立 5周龄、雄性 C57BL/6小鼠随机分为正常安静组(NC)和正常运动组(NE)。5周龄 AMPKα2基因敲除小鼠共有三种基因型，即野生型(WT)、杂合子型(AMPKα2+/-)和纯合子型(AMPKα2-/-)。分别将各基因型小鼠随机分为安静对照组(C)和有氧运动组(E)。 2.腺病毒的构建 利用 Gateway克隆技术构建 HDAC4, HDAC5, MEF2A和 AMPKα2过表达重组腺病毒质粒，采用 PacI内切酶线性化后转染293A细胞进行腺病毒包装。AMPKα2显性负突变腺病毒是通过 Gateway克隆技术构建过表达质粒后进行点突变，再进行腺病毒载体的重组及包装。 3．细胞培养及干预 小鼠肌原细胞系 C2C12经2%马血清培养诱导分化为肌管细胞。观察HDAC4,MEF2A和HDAC5过表达腺病毒以及HDAC4和HDAC5 siRNA干预肌管细胞对葡萄糖代谢的影响；检测 AMPKα2过表达腺病毒及 AMPKα2显性负突变腺病毒对肌管细胞HDAC4的影响；使用miR-206 mimic和miR-206 inhibitor转染肌管细胞，观察葡萄糖代谢的变化。 4．生化指标检测 采用Real-time PCR检测基因表达；采用Western Blot方法检测蛋白表达；使用2-脱氧葡萄糖荧光类似物(2-NBDG)检测 C2C12肌管细胞葡萄糖摄取能力；采用免疫共沉淀(Co-IP)检测蛋白间的相互结合；采用免疫荧光检测蛋白表达及细胞内定位。 研究结果： 1. HDAC4/5在有氧运动改善骨骼肌糖代谢中的作用 6周有氧运动可以显著增加小鼠骨骼肌组织 GLUT4 mRNA和蛋白表达、HDAC4 Ser246位点磷酸化，同时促进 HDAC4从细胞核转移至胞浆。通过离体细胞实验发现肌管细胞 HDAC4表达的增加可抑制细胞 GLUT4转录及其对葡萄糖摄取能力，当增加 MEF2A的表达水平可逆转 HDAC4的抑制作用。 HDAC4 siRNA显著增加肌管细胞GLUT4基因转录水平，在此基础上给予HDAC5 siRNA,GLUT4基因转录水平被大幅度提高。与之相反，同时过表达HDAC4和 HDAC5对于 C2C12肌管细胞 GLUT4的转录抑制效率显著高于单独过表达 HDAC4或 HDAC5。由此推测，骨骼肌细胞 HDAC4与 HDAC5可能在 GLUT4的转录调控过程中发挥着协同作用。 有氧运动显著降低氧化型肌纤维 HDAC4和 HDAC5蛋白表达，然而在酵解型肌纤维中却无显著变化。此外，有氧运动也显著降低骨骼肌细胞 HDAC4和HDAC5的相互结合(图1.8)。由此提示，有氧运动对 HDAC4和 HDAC5蛋白表达调控具有肌纤维类型的特异性，对其下游靶基因的抑制作用可能与二者的相互结合有关。 2. AMPKα2在有氧运动调控骨骼肌组织 HDAC4/5中的作用 离体状态下敲低 AMPKα2可导致 HDAC4 Ser246/632位点的磷酸化水平显著降低，促使 HDAC4从细胞核转移至胞浆。提示骨骼肌细胞 AMPKα2是HDAC4的上游激酶。 单次有氧跑台运动可以激活野生型小鼠骨骼肌 AMPK-HDAC4信号通路；然而有氧运动未能增加AMPKα2缺失小鼠骨骼肌HDAC4 Ser246/632磷酸化水平，提示运动对于骨骼肌组织 HDAC4的激活依赖于AMPKα2。 3. miR-206介导 HDAC4在有氧运动提高骨骼肌葡萄糖代谢中的作用机制 6周的有氧运动显著增加氧化型肌纤维 miR-206的表达水平、抑制HDAC4蛋白表达、显著增加 GLUT4 mRNA及蛋白表达。由此推测有氧运动可能通过 miR-206降低 HDAC4的蛋白表达，进而增加骨骼肌细胞 GLUT4的转录。 离体研究发现，miR-206水平的增高可显著降低 HDAC4的蛋白表达、增加骨骼肌细胞 GLUT4基因的转录、提高了骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取。因此提示 miR-206可能通过抑制 HDAC4促进骨骼肌细胞 GLUT4的转录，进而增加了对葡萄糖的摄取能力。 采用miR-206 mimic和HDAC4 siRNA共转染肌管细胞，发现miR-206和GLUT4的转录水平显著低于单独使用miR-206 mimic干预的肌管细胞。随后检测发现，采用HDAC4 siRNA可显著降低C2C12肌管细胞miR-206的表达水平，甚至与 miR-206 inhibitor干预后结果无显著差异。由此说明，HDAC4 siRNA反馈性的抑制骨骼肌细胞 miR-206的表达。 此外，以不同浓度梯度miR-206 mimic孵育肌管细胞，GLUT4的基因表达随着浓度梯度增加而增加，之后转染肌管细胞过表达 HDAC4腺病毒， GLUT4基因表达虽显著高于对照组，但显著低于单独使用miR-206 mimic干预组，提示 miR-206通过 HDAC4调控肌管细胞 GLUT4的基因表达。 研究结论： 1. HDAC4通过 MEF2A调控骨骼肌细胞 GLUT4的基因转录，且在转录调控的过程中 HDAC4/5可能发挥着协同作用。有氧运动对于 HDAC4/5的影响具有肌纤维类型的特异性，唯有在氧化型肌纤维中的表达水平显著降低，可能是有氧运动促进骨骼肌有氧氧化，提高机体对糖脂代谢的重要机制。 2. AMPK能够调控骨骼肌细胞 HDAC4活性。单次有氧运动通过 AMPKα2所依赖的方式激活骨骼肌细胞 HDAC4。 3. miR-206 mimic显著抑制骨骼肌细胞 HDAC4的蛋白表达，同时增加GLUT4转录、促进骨骼肌对葡萄糖的摄取。此外，有氧运动可能通过miR-206调控氧化型肌纤维 HDAC4的蛋白表达、促进机体的葡萄糖代谢。
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