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DEL3调控拟南芥幼年向成年阶段转变的机制研究
周冰莹1
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摘要
植物幼年向成年阶段转变是植物发育过程中一个关键过程。该发育过程调控植物生殖生长、植物株型及生物量、次生代谢产物合成、生物与非生物胁迫等多种生长发育过程以及重要经济性状，因此开展植物幼年向成年阶段转变的分子机制研究具有重要的理论及应用意义。研究表明，植物幼年向成年阶段转变受保守的miR156-SPLs主效途径调控，但至今对该途径的上下游调控网络研究积累较少。 为研究miR156上游的调控机制，在拟南芥中开展了EMS化学诱变结合正向遗传学筛选方法，筛选幼年向成年阶段转变突变体。我们筛选获得了一份拟南芥幼年向成年阶段转变延迟突变体（Delayed juvenile-to-adult phase transition mutant3，简称del3）。表型分析表明，del3表现为下表皮毛发生叶位延迟、植株个体发育迟缓、叶片黄化、叶片褶皱且缺刻增多、果荚异常等多样性发育缺陷表型。 图位克隆确定del3突变位于拟南芥第Ⅳ号染色体T22A6(B)和F23E13(B)标记引物之间。通过对区间内所有基因功能分析发现，del3突变体同ATase2（编码谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转氨酶，AT4G34740）缺失突变体cia1-2具有相似突变表型。候选基因测序分析显示del3突变体中AT4G34740编码开放阅读框(ORF)第725位G碱基突变为A，造成第242位甘氨酸突变为天门冬氨酸。遗传等位互补测定确定del3与cia1-2为等位突变体。上述结果表明，del3的幼年向成年阶段转变表型确实是由于AT4G34740基因突变所致。 我们利用qRT-PCR方法检测了野生型(WT)与del3中miR156-SPLs信号途径相关基因的表达。结果显示:同WT相比，del3中pri-MIR156A和pri-MIR156C表达显著上调，而miR156、SPL9、SPL13、pri-MIR172B表达不变，miR172和SPL3则显著下调。为了验证del3是否调控miR156A位点及SPL3的转录，我们把miR156A位点及SPL3转录水平GUS报告基因株系pMIR156A∷GUS和pSPL3∷rSPL3-GUS分别杂交到del3中，GUS染色分析表明del3直接影响了miR156A位点及SPL3的转录。遗传互作分析显示:miR172过表达（Ubi10∷MIR172B）株系和toe1/toe2双缺突变体可回复del3突变体幼年向成年阶段转变延迟表型，表明del3突变体幼年向成年阶段转变延迟与miR172下调相关，miR172作用于DEL3的下游。 DEL3为核基因组编码的叶绿体蛋白，具有调控叶绿体早期发育和嘌呤合成的双重功能。DEL3缺失突变（cia1-2、dg169）导致叶绿体发育异常、光合作用缺陷。研究表明，叶绿素b缺陷突变体ch1-4中由于糖积累较低导致miR156主效位点pri-MIR156A和pri-MIR156C显著上调表达，miR156成熟体表达上调。我们结果显示，del3突变体中光合作用缺陷导致糖积累较低同样造成突变体中pri-MIR156A和pri-MIR156C显著上调表达，但是miR156成熟体含量在del3突变体中不变。此外，外源添加糖也仅能部分回复del3幼年向成年阶段转变延迟表型。上述结果表明，DEL3可通过叶绿体发育—光合作用—糖信号途径作用于miR156-SPLs途径，但除此之外，DEL3还存在其它方式调控miR156-SPLs途径。 del3突变体中miR156/pri-MIR156比值和miR172/pri-MIR172比值(miRNA成熟体比前体)显著低于WT。本研究随机选取其它9个miRNA及其pri-MIRNAs进行检测，发现del3突变体中miRNA/pri-MIRNAs比值均显著低于WT，这些结果表明del3为一个miRNA加工缺陷突变体，这也与其所表现出的同其它miRNA加工缺陷突变体相同的具有一因多效的发育缺陷表型相一致。遗传分析结果显示，miRNA加工途径突变体hyl1-2、se-1均能显著回复del3突变体幼年向成年阶段转变延迟表型，因此hyl1-2、se-1上位于del3。 基于上述研究结果，我们提出了DEL3调控拟南芥幼年向成年阶段转变发育的两个作用过程:1、DEL3调控叶绿体发育，通过光合作用—糖信号途径抑制pri-MIR156A和pri-MIR156C表达。del3中由于叶绿体发育和光合作用缺陷导致糖含量降低，解除了糖对miR156前体表达的抑制作用，最终导致miR156主效前体pri-MIR156A和pri-MIR156C显著上调。2、DEL3负责嘌呤合成代谢，并通过影响或者参与叶绿体—核逆行信号调控核miRNA加工过程。del3突变体中，尽管pri-MIR156A和pri-MIR156C前体显著上调，但是由于存在miRNA加工缺陷，导致miR156成熟体表达水平在del3中变化不大，而miR172由于前体受del3影响不大，因此miRNA加工缺陷导致成熟体miR172显著下调。综上所述，本研究证明DEL3可通过叶绿体—光合作用—糖信号途径和嘌呤代谢—miRNA加工途径，参与调控miR156-SPLs途径，进而调控幼年向成年阶段转变发育过程。
关键词
植物发育/幼年向成年阶段转变延迟突变体/叶绿体/光合作用/糖代谢/嘌呤代谢/微小核糖核酸-156引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
园艺导师
吴刚学位年度
2017学位授予单位
浙江农林大学语种
中文中图分类号
Q94