摘要
背景与目的：睡眠剥夺(Sleep deprivation,SD)可对认知功能造成严重伤害，究其如何防治具有重要意义。海马作为大脑边缘系统中的关键组成部分，是参与学习记忆调节的重要中枢，海马损伤是认知功能障碍发生的关键环节。沉默信息调节因子1(Silence signal regulatingfactor1,Sirt1)，作为Sirtuins家庭中的一员，在海马中高度表达，不仅对海马损伤具有重要的保护作用，还对突触可塑性及学习记忆起重要调节作用。硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)作为一种新型的神经调质，具有确切的神经保护作用和学习记忆调节功能，且我们已发现H2S具有上调神经细胞Sirt1表达的作用。据此，我们提出了“H2S可通过上调Sirt1发挥抗SD后认知障碍，其机制涉及拮抗海马损伤”的工作假设。为此，本实验采用改良多平台法(modified multiple platform method,MMPM)建立SD的动物模型，探讨H2S对SD后认知功能障碍拮抗作用及其机制。 方法：雄性Wistar大鼠连续SD72h（采用MMPM法）建立SD动物模型；Y迷宫、新物体识别和Morris水迷宫试验评价大鼠认知功能；HE染色观察海马CA3区细胞排列情况及细胞形态；Tunel染色检测海马区神经细胞凋亡；NNDPD(N,N-dimethyl-p-phenylenediamine sulphate)法检测海马内H2S生成水平；Western blotting检测海马组织中胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-bata-synthase,CBS)、3-巯基丙酮酸转移酶(3-mercaptopyruvate sulphurtransferase,3-MST)、Sirt1、Bcl-2及Bax蛋白的表达；Elisa法测试大鼠海马组织中Caspase-3的含量。 结果： 1.睡眠剥夺(SD)导致大鼠认知功能障碍。Wistar大鼠予连续SD72h后行认知相关行为学检查，结果显示，SD大鼠Y迷宫交替正确率下降、新物体识别指数降低、水迷宫实验获得性训练期第五天找到平台的潜伏期延长、水迷宫空间探查实验穿过原平台次数、目标象限时间比和中环时间比下降。上述结果表明，SD可导致大鼠认知功能障碍。 2.SD导致大鼠海马损伤。72h-SD可导致大鼠海马CA3区神经细胞数量明显减少且呈排列疏散无序、凋亡细胞数目明显增加，并可致海马内Caspase-3活性增强、Bcl-2表达减低和Bax表达增加。上述结果表明，SD可诱导大鼠海马损伤。 3.SD导致大鼠海马内源性H2S生成能力下降。72h-SD可导致大鼠海马内H2S生成酶CBS、3-MST的表达及H2S的生成减少。上述结果表明，SD可降低大鼠海马内H2S的生成。 4.H2S可改善睡眠剥夺(SD)大鼠的认知功能。大鼠给予NaHS(30和100μmol/kg,ip)预处理7d后，再与SD共同处理72h，行认知相关行为学检查，发现NaHS(30和100μmol/kg)可增加SD大鼠的Y迷宫交替正确率、提高SD大鼠的新物体识别指数、缩短Morris 水迷宫获得性训练期第五天SD大鼠找到平台的潜伏期、增加SD大鼠穿过原平台的次数、在目标象限时间比及中环游泳时间比。上述结果表明，H2S对SD诱导的认知功能障碍具有改善作用。 5.H2S可减轻睡眠剥夺(SD)大鼠的海马损伤。大鼠给予NaHS(30和100μmol/kg,ip)预处理7d后，再与SD共同处理72h后，分离海马组织，行相关生物学指标检查，发现NaHS(30和100μmol/kg)可改善 SD大鼠海马神经细胞数量减少及排列紊乱的现象、减少SD大鼠海马CA3区神经细胞的凋亡、降低SD大鼠海马内Caspase-3的活性、增加SD大鼠海马内Bcl-2的表达及降低Bax的表达。上述结果提示，H2S可减轻SD诱导的大鼠海马损伤。 6.H2S可上调睡眠剥夺（SD）大鼠海马内Sirt1的表达。72h-SD可降低大鼠海马内Sirt1的表达，NaHS(30和100μmol/kg)可增加SD大鼠海马内Sirt1的表达，提示H2S可上调SD大鼠海马内Sirt1的表达。 7.Sirtinol(Sirt1抑制剂)逆转H2S对睡眠剥夺（SD）大鼠认知功能的改善作用。大鼠给予NaHS(30和100μmol/kg,ip)预处理7d后，再同时给予72h-SD及Sirtinol(10nmol/d,icv,for3d)，行认知相关行为学检查，结果显示，Sirtinol(10nmol)可逆转H2S对SD大鼠Y迷宫交替正确率的提高作用、新物体识别指数的增加作用、Morris水迷宫获得性训练期第五天找到平台的潜伏期的缩短作用、水迷宫空间探查实验穿过原平台次数、在目标象限时间比及中环游泳时间比的增加作用。上述结果提示，抑制Sirt1可逆转H2S对SD大鼠认知功能的改善作用。 8.Sirtinol逆转H2S对睡眠剥夺（SD）大鼠海马损伤的拮抗作用。Sirtinol(10nmol)可抑制H2S对SD大鼠海马CA3区神经细胞数量减少、排列紊乱及凋亡细胞数目增加的拮抗作用，并可克服H2S对SD大鼠海马内Caspase-3活性的增加作用、Bcl-2表达的增加作用及Bax表达的减少作用。上述结果提示，抑制Sirt1可逆转H2S对SD大鼠海马损伤的改善作用。 结论： 1. H2S可改善SD诱导的认知功能障碍及海马损伤； 2. H2S可通过上调海马Sirt1的表达改善SD诱导的认知功能障碍：涉及到减轻海马损伤。
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