摘要
目的:为了获取活性和纯度更高的广西眼镜蛇毒神经生长因子(NerveGrowth Factor,NGF)，对原有的分离纯化方法进行改良。并探索分离纯化所得的NGF对大鼠肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell-T6，HSC-T6)应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(Stress Activated Protein Kinase/c-JunN-terminal Kinase，SAPK/JNK)信号通路中JNK表达量的影响，进而阐明NGF通过SAPK/JNK信号通路抑制肝星状细胞增殖的机制。 方法:采用DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Sephadex G-50凝胶层析柱和Macro-prep HighS强阳离子交换柱对广西眼镜蛇毒粗毒进行纯化。采用大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（Rat Pheochromocytoma Cells，PC12），对每一步分离纯化后所得各组分的NGF活性进行检测，并确定可使PC12细胞分化的最小NGF浓度。采用CCK-8(Cholecystokinin-octo Peptide)法检测NGF对HSC-T6细胞的增殖抑制作用。采用免疫印记(Westem Blot,WB)法检测NGF作用HSC-T6细胞后，SAPK/JNK信号通路中JNK表达量随时间（0min、5min、10min、30min、60min、120min和24h）的变化情况，以及加入抑制剂处理后SAPK/JNK信号通路中JNK的表达随时间的变化情况。抑制剂处理的分组为空白组、抑制剂组、NGF组和抑制剂+NGF组。 结果:通过DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Sephadex G-50凝胶柱、Macro-prep HighS强阳离子交换柱分离纯化广西眼镜蛇毒，得到的第二峰具有NGF活性，诱导PC12细胞分化的最小浓度为0.1μg/ml。其分子量约为23kDa，并且达到电泳纯。该NGF对HSC-T6细胞具有增殖抑制作用，最佳抑制浓度为1μg/ml。以1μg/ml的NGF用于HSC-T6细胞不同时间后，各时间节点的JNK的表达量没有显著差异，磷酸化的JNK的表达量随作用时间的延长而减少。以10μmol/L的抑制剂和1μg/ml的NGF作用于HSC-T6细胞后，可以显著的抑制磷酸化JNK的表达量。 结论:通过DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Sephadex G-50凝胶柱、Macro-prep HighS强阳离子交换柱可分离纯化得到高活性的NGF。NGF对SAPK/JNK信号通路中磷酸化JNK的表达具有抑制作用，可能通过抑制SAPK/JNK信号通路来影响肝纤维化的发生和发展。
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