摘要
研究背景及目的: 常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是由单基因突变引起的遗传性肾脏疾病，也是最常见的遗传性肾病。它主要由PKD1或PKD2基因突变引起。其主要病理特点是肾囊肿形成，并逐渐增大压迫替代正常肾组织引起肾功能恶化，最终导致肾衰竭。ADPKD患病率为1-2.5‰，通常发生在30岁至40岁，约占终末期肾病患者病因8-10％。近年来多囊肾病的研究取得一定进展，但目前尚无有效的逆转其进程的治疗方法。研究发现起源于正常肾小管上皮细胞的囊肿衬里上皮细胞不断增殖、去分化是多囊肾病发生和发展的关键因素，这与良性肿瘤的增殖有许多相似之处。 Enhancer ofzeste homolog2(EZH2)是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶，能够催化组蛋白H3第27赖氨酸三甲基化，参与众多生命过程。研究发现EZH2在多种实体肿瘤中高表达，如肺癌、膀胱癌、卵巢癌，已经成为肿瘤治疗的热点和新靶点。EZH2介导的非组蛋白甲基化是十分重要的翻译后修饰，参与许多生命过程，如细胞周期、DNA修复、细胞衰老、分化、凋亡和肿瘤发生。 我们实验室前期分析芯片数据，结果显示在大鼠多囊肾组织中EZH2高表达，其表达随大鼠周龄增加而增加，提示EZH2可能在多囊肾病中起作用。目前，国内外尚无多囊肾病与EZH2关系的报道，EZH2在多囊肾病中的作用尚待研究。本研究拟从细胞、组织、器官及整体水平，探索EZH2作为多囊肾病治疗新靶点的的价值，研究EZH2介导的STAT3甲基化在多囊肾病发病中的作用和机制，从而为多囊肾病寻找新的治疗靶点提供理论基础和实验依据。内容主要分以下4部分。 第一部分:EZH2在多囊肾组织中的表达和活性 目的:明确EZH2在人、鼠多囊肾组织中的表达情况 方法:收集人多囊肾组织及正常对照肾组织标本、Pkd1敲除小鼠及野生型小鼠肾组织标本，运用PCR、Western Blot方法，检测EZH2在多囊肾组织中的表达，并通过检测其特异性底物组蛋白H3第27赖氨酸甲基化含量来反映EZH2活性。 结果:EZH2 mRNA水平和蛋白水平在多囊肾病患者肾组织中均明显高于正常对照组，且酶活性升高;EZH2在Pkd1敲除小鼠多囊肾组织中的表达及活性显著高于野生型组。 结论:EZH2在多囊肾组织中的表达和活性显著升高。 第二部分:EZH2抑制剂对囊肿衬里上皮细胞增殖及Pkd1敲除小鼠肾囊肿生长的作用及机制 目的:观察EZH2选择性抑制剂GSK126对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖及Pkd1敲除小鼠肾功能和肾囊肿的作用及机制。 方法:应用EZH2选择性抑制剂GSK126处理对数期生长的多囊肾病囊肿衬里上皮细胞(WT9-12)，用MTT法测定其对WT9-12细胞增殖的抑制作用，用LDH毒性释放实验检测GSK126对WT9-12细胞的毒性作用;采用Pkd1敲除小鼠腹腔注射EZH2选择性抑制剂GSK126，3周后留取组织标本和血清，观察小鼠肾重/体重、血肌酐、血尿素氮等肾功能指标变化，探索EZH2作用多囊肾病新靶点的治疗作用;构建EZH2质粒、干扰RNA，在WT9-12细胞中过表达和抑制EZH2，通过Western blot研究EZH2对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞STAT3活性的作用，并在Pkd1敲除小鼠模型中验证。 结果:EZH2选择性抑制剂GSK126抑制多囊肾病细胞增殖，且抑制增殖的药物浓度对细胞无毒性作用;EZH2选择性抑制剂GSK126延缓Pkd1敲除小鼠囊肿增长，降低Pkd1敲除小鼠肾重/体重，降低Pkd1敲除小鼠血肌酐、血尿素氮水平，改善Pkd1敲除小鼠肾功能;在囊肿衬里上皮细胞WT9-12中，通过质粒转染过表达EZH2引起STAT3的活性增加，通过EZH2选择性抑制剂GSK126和（或）干扰RNA下调EZH2表达，导致STAT3磷酸化呈现浓度依赖性降低;EZH2选择性抑制剂GSK126抑制Pkd1敲除小鼠肾组织中STAT3活性。 结论:EZH2抑制剂能够抑制囊肿衬里上皮细胞增殖，延缓Pkd1敲除小鼠肾囊肿的进展，改善Pkd1敲除小鼠肾功能，EZH2可能成为多囊肾病治疗的新靶点;EZH2通过调节STAT3磷酸化活性参与影响多囊肾病的进展。 第三部分:过表达EZH2促进斑马鱼肾囊肿的形成 目的:过表达EZH2观察其促进斑马鱼肾囊肿的形成。 方法:利用pCS2-EGFP作为载体，通过限制性内切酶BamHⅠ/XhoⅠ构建斑马鱼pCS2-EZH2-EGFP质粒，将质粒利用NotⅠ线性化通过试剂盒转录合成EZH2全长mRNA。通过显微注射在斑马鱼中过表达EZH2，观察过表达EZH2是否能够促进斑马鱼产生前肾囊肿。 结果:过表达EZH2，部分斑马鱼出现前肾囊肿，比例为17.1％±9.8％，空白载体对照组斑马鱼无前肾囊肿产生。 结论:EZH2参与并促进斑马鱼肾囊肿的形成。 第四部分:EZH2及其介导的STAT3甲基化在多囊肾病发病机制中作用 目的:探索EZH2在多囊肾病中表达增加的机制以及EZH2介导的STAT3甲基化在多囊肾病发病机制中的作用。 方法:通过cAMP激活剂(Forskolin)、cAMP类似物(8-Br-camp)和竞争性抑制剂(Rp-camp)、PKA激活剂(H89)探索cAMP/PKA通路对EZH2在多囊肾病中表达和活性的影响;通过免疫共沉淀和Western blot探索在ADPKD中EZH2与STAT3是否能够直接结合、相互作用，在多囊肾病中STAT3的甲基化是否高表达;通过免疫共沉淀和Western blot探索EZH2选择性抑制剂GSK126能否抑制STAT3甲基化进而调节STAT3活性。 结果:cAMP激活剂(Forsklin)、cAMP类似物(8-Br-camp)增加囊肿衬里上皮细胞WT9-12中EZH2的表达和活性，cAMP竞争性抑制剂(Rp-camp)、PKA激活剂(H89)下调WT9-12细胞中EZH2的表达和活性。在多囊肾病患者肾组织和WT9-12细胞中，EZH2均能与STAT3直接结合;在多囊肾病患者肾脏组织中STAT3甲基化高表达;EZH2选择性抑制剂GSK126抑制WT9-12细胞中STAT3甲基化，进而调节STAT3磷酸化活性。 结论:在多囊肾病中EZH2的表达受cAMP/PKA通路的调节，EZH2调节STAT3甲基化，进而调节STAT3活性，在多囊肾病进展中起到重要作用。
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