摘要
黄酮类化合物作为一类重要的次生代谢产物，具有广泛的药理活性，决定着许多中药材的品质。因此，研究黄酮类生物合成途径关键酶基因的功能对于阐明中药品质形成的分子机制具有重要意义。红花（Carthamus tinctorius L.）是著名的药用植物，其花活血通经、散瘀止痛，具有抗凝血、抗氧化、耐缺氧、防治血栓形成等多种药理作用，是活血祛瘀类的代表中药。红花中含有的查尔酮类成分和多种黄酮醇化合物如羟基红花黄色素A、槲皮素及其苷类、山柰酚及其苷类等是红花发挥活血化瘀活性的重要物质基础。但是，由于植物次生代谢生物合成途径的极其复杂性，加之红花的品质成分羟基红花黄色素A(HSYA)仅在花中特异性积累、红花本身的组织培养再生率低以及生根困难等问题，一直以来对红花黄酮生物合成途径的研究进展相当缓慢，制约着通过植物基因工程手段提高红花品质的步伐。大量研究表明，查尔酮合酶是黄酮类化合物形成的入口酶，调控着黄酮类成分的合成，因此，深入研究红花查尔酮合酶基因的功能，对于阐释红花品质形成的分子机制、进而从基因水平定向调控红花的品质具有重要意义。 课题组前期在构建红花花冠cDNA文库、进行基因测序和注释以及定制红花原位合成基因芯片比较不同开花时间点花冠基因表达差异的基础上，获得了红花中HSYA时序性差异表达的基因，并通过KOBAS分析，获得了KEGG数据库中黄酮代谢途径通路上显著性差异表达的基因，如:肉桂酸4-羟基化酶(C4H)、查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮2-羟基化酶(F2H)、AT4G33360基因等。并克隆了查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)基因CtCHS533等黄酮代谢途径的多条关键酶基因。 本论文在上述研究工作的基础上，应用cDNA末端快速扩增(rapid amplificationof cDNA ends，RACE)技术，继续克隆红花的CHS基因，获得2条红花CHS基因全长:CtCHS3720、CtCHS1515。生物信息学分析显示CtCHS3720氨基酸序列与菊花（Chryscanthemum boreale）CHS氨基酸序列(AGU91424.1)的同源性最高，覆盖度达94％，匹配度达到91％。依据protparam预测CtCHS3720全长序列编码的蛋白质分子量为43667.25Da，预测理论等电点为5.72。CtCHS1515氨基酸序列与毛果杨(Populus trichocarpa)CHS氨基酸序列(XP006375238.1)的同源性最高，覆盖度达93％，匹配度达到82％。依据protparam预测CtCHS1515全长序列编码的蛋白质分子量为43016.36Da，预测理论等电点为5.67。依据系统进化树图谱分析，CtCHS3720、 CtCHS533和CtCHS1515在聚类分支上距离较远，推测3个CHS基因在氨基酸活性催化功能上存在较大差异性。 为了深入研究红花的3个CHS基因，本论文以课题组前期研究发现并经多代纯化选择获得的红花不同化学型（即以HSYA为主成分的HSYA型和以山柰酚及其苷类为主的KAEG型，云南巍山红花和新红花7号）为材料，均匀种植于温室，以茉莉酸甲酯(MeJA，100μM)分别刺激开花当天的花冠，采用qPCR法，于刺激后0.1h，3h，6h，12h分析3个基因CtCHS3720、CtCHS1515、CtCHS533的相对表达量。结果表明，3个基因响应MeJA诱导的模式因品系不同而不同。CtCHS3720基因的表达量在诱导云南巍山红花的0.1h、3h和6h明显升高，特别在诱导6h，表达量提高了2.3倍，诱导12h，则没有明显变化;而MeJA诱导新红花7号后，CtCHS3720基因的表达量则有所降低，在诱导后的6h和12 h降低最明显。CtCHS1515基因的表达量在诱导云南巍山红花0.1h、3h、6h和12h明显降低;CtCHS1515基因在诱导新红花7号的不同时间点表达量均较低，对MeJA的诱导响应也不明显;CtCHS533基因在云南巍山红花的3h、6h和12h，表达量均降低，而MeJA在新红花7号诱导的0.1h表达量明显上升，诱导3h、6h和12h则没有明显变化。提示CtCHS3720、CtCHS1515和CtCHS533基因对红花黄酮类生物合成途径的贡献度因品系不同而不同，可能参与了红花不同化学型品系的形成过程。 UPLC-QTOF/MS检测MeJA诱导后不同时间点(0.1 h、3h、6h、12 h)红花不同品系花冠12个黄酮类成分D-Phenylalanine、Hydroxysaffloryellow A、Rutin、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Kaempferol-3-O-β-rutinoside、Kaempferol、Apigenin、Dihydrokaepferol、Quercetin3-β-D-glucoside、Scutellarin、Carthamin、Luteolin的积累情况，从含量变化折线图可以看出，不同品系12个黄酮成分均受到MeJA的诱导，但成分种类和积累模式存在明显不同。Hydroxysaffloryellow A、Carthamin、Luteolin、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside仅在云南巍山红花中有积累，而且Hydroxysaffloryellow A的积累量远远高于其他黄酮成分，特别在诱导的3h、6h，D-Phenylalanine、Kaempferol-3-O-β-rutinoside、Carthamin的积累量均高于对照组，Kaempferol、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Luteolin、Quercetin-3-β-D-glucoside的积累则受到不同程度的抑制。Dihydrokaepferol、Apigenin、Scutellarin仅在新红花7号中有积累，特别在在诱导的0.1 h、3h、6h，Apigenin、D-Phenylalanine、Dihydrokaepferol、Kaempferol、Quercetin-3-β-D-glucoside、的积累被抑制，而Kaempferol-3-O-β-rutinoside、Rutin则持续升高，而Scutellarin在4个时间点积累均受到抑制，提示红花不同品系黄酮成分的种类与积累模式的不同可能是导致不同化学型形成的重要原因。 整合分析CtCHS3720、CtCHS1515和CtCHS533基因响应MeJA诱导的表达量与黄酮类化合物积累量的关联分析显示，云南巍山红花Hydroxysaffloryellow A、D-Phenylalanine、Carthamin的积累量与CtCHS3720的表达均成正相关(r=0.92、0.88、0.76);提示CtCHS3720、CtCHS533可能是云南巍山红花形成HydroxysaffloryellowA和Carthamin的关键基因; CtCHS1515在新红花7号中与Scutellarin的积累有正相关关系(r=0.64)，可能是新红花7号形成Scutellarin的关键基因。 采用无缝克隆技术构建了CtCHS3720与真核表达载体pMT39的重组质粒并转化了LBA4404农杆菌。洋葱表皮的亚细胞定位显示，CtCHS3720基因在细胞膜和细胞核表达。 将构建的原核表达重组载体质粒转入原核表达宿主菌体BL21(DE3)pLysS中，加入IPTG诱导表达融合蛋白。CtCHS3720和CtCHS1515分别编码分子量为43.6kD和43kD的蛋白质。体外构建酶促反应体系验证CtCHS3720所编码酶可催化1分子的香豆酰COA(p-coumaryl-COA)和3分子的丙二酰COA(malonyl-COA)生成柚皮素，证明CtCHS3720所编码的酶具有体外催化活性。
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