摘要
聚酮化合物是一类在植物、真菌、细菌中发现的具有广泛生物活性和结构多样性的天然产物。但在一些天然真菌产聚酮活性产物过程中，往往存在合成基因簇处于沉默状态、遗传操作困难、发酵周期长、产量低且副产物多等诸多问题，使聚酮活性产物的获取变得困难。近年来，随着合成生物学的飞速发展，采用优良的底盘细胞来异源合成活性天然产物已引起广泛关注，可有效解决上述问题。本课题拟通过巴斯德毕赤酵母作为底盘细胞分析抗癌聚酮化合物土曲霉酸合成过程中相关基因的功能，并异源重构土曲霉酸的合成途径，实现土曲霉酸的异源合成。通过单个及组合表达土曲霉酸基因簇中的各功能基因，并通过适当的表达优化，分析并确证基因功能;通过功能基因的组合表达实现土曲霉酸及中间产物的合成。 2014年，美国科学家通过基因敲除的方法确定了土曲霉NIH2624中的土曲霉酸合成基因簇，并初步推断了基因簇中相关基因的生物学功能。该基因簇包含8个基因:atX（编码6-甲基水杨酸合成酶），atA（编码6-甲基水杨酸脱羧酶）、atB（编码转运蛋白）、atC（编码氧化还原酶）、atD（编码未知功能蛋白）、atE（编码P450单氧酶）、atF（编码转录因子）、atG（编码P450单氧酶）。由于在毕赤酵母中异源组装土曲霉酸合成途径时，基因表达控制使用的是毕赤酵母自身的启动子和转录因子，且产物合成过程不需要转运蛋白的参与，因此本课题首先聚焦在atA、atC、atD、atE、atG五个基因在土曲霉酸合成过程中的功能。 本课题组前期研究发现，在毕赤酵母中表达构巢曲霉来源的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(编码基因npgA)可成功将无活性的apo-ACP修饰为有活性的holo-ACP，从而激活聚酮合成。因此，本课题首先在毕赤酵母中通过共表达npgA和atX获得了重组菌株GS115-NX，并成功合成了6-甲基水杨酸。然后，通过基因结构分析及逆转录PCR成功鉴定了atA、atC、atD、atE、atG基因的内含子，并通过移除内含子获得了准确的开放阅读框。然后，将atA转入重组菌株GS-NX获得了菌株GS-NXA，且6-甲基水杨酸被进一步转化为3-甲基邻苯二酚;将atA和atE转入GS-NX后获得菌株GS-NXAE，3-甲基邻苯二酚被进一步催化反应，推测转化产物为1，2，4-三羟基-3-甲基-苯，然而该产物非常不稳定，纯化后在体外环境中很快转化为其他物质，因此无法获得纯品进行核磁分析以确定准确结构;继续将atA，atE，atG转入GS-NX后获得菌株GS-NXAEG，然而没有新产物合成，这与文献中预测的atG的功能无法吻合;然而，将atD转入GS-NXAE后获得了菌株GS-NXAED，且合成了新化合物terremutin，证明在1，2，4-三羟基-3-甲基-苯转化为terremutin的过程中，是atD而非atG在发挥核心功能，纠正和补充了美国科学家的实验结果;将atG转入GS-NXAED后获得了菌株GS-NXAEDG，然而terremutin的合成并未得以增强，说明atG无法协同atD发挥催化功能;最后将atC和atD转入GS-NXAE获得了菌株GS-NXAEDC，成功实现了土曲霉酸合成途径在毕赤酵母中的重构，并异源合成了终产物土曲霉酸。 本文的意义在于通过组合生物合成方法成功地确定了土曲霉酸生物合成中的关键基因及功能，且通过实验获得了相关中间产物并解析了化学结构，弥补了在天然菌株中无法获得部分中间产物而只能理论推测的缺陷。同时，通过表达实验纠正了文献中关于atG和atD功能的推测。该工作对于系统理解土曲霉酸生物合成机制有较好的价值，对于在毕赤酵母中异源合成聚酮活性产物也起到了很好的借鉴意义。
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