摘要
目的: 研究发现，肝气郁结介导β-AR信号通路可以促进恶性肿瘤的侵袭、转移。本课题拟通过研究E对于M2型巨噬细胞对结肠癌转移的影响，分析β-AR信号通路在其中的作用，最后采用逍遥散，观察疏肝理气法通过抑制M2巨噬细胞的极化在防治肿瘤浸润转移中的作用。 方法: 1、通过E溶液刺激THP-1细胞，激活β-AR信号通路，并用普萘洛尔抑制通路的作用，再对THP-1进行PMA+IL-4诱导，观察β-AR信号通路对于M2型巨噬细胞生成的影响。制作β2-AR敲除的THP-1细胞，观察β2-AR敲除后的THP-1细胞经过E溶液刺激后是否能影响M2型巨噬细胞的生成。 2、Transwell侵袭实验观察E对M2型巨噬细胞细胞对HCT116细胞体外侵袭能力的影响，qRT-PCR和Western blot检测E干预后M2型巨噬细胞MMP-2、MMP-9和VEGF表达情况，qPCR检测IL-1β、TNFα等mRNA表达情况。 3、运用免疫荧光双染法检测组织芯片中结肠癌患者β2-AR以及CD206表达情况，并根据患者情况进行分析，分析该表达与患者肿瘤转移浸润之间的关系。 4、制作逍遥散含药血清，观察逍遥散含药血清能否影响M2型巨噬细胞的生成。Transwell侵袭实验观察E和逍遥散含药血清共同作用于M2型巨噬细胞细胞对HCT116细胞体外侵袭能力的影响，qRT-PCR和Western blot检测E或逍遥散含药血清干预后M2型巨噬细胞MMP-2、MMP-9和VEGF表达情况，qPCR检测IL-1β、TNFα等mRNA表达情况。 5、通过皮下注射E构建肝气郁结模型，通过ELISA检测小鼠下丘脑、外周血5-HT、CRH含量，旷场实验，糖水偏食实验客观评价E构建的肝气郁结模型。在肝气郁结模型的基础上，通过脾内注射人结肠癌细胞HCT116建立肝转移模型，观察肝气郁结对于肿瘤转移的影响。 6、BALB/C裸小鼠随机分为空白对照组、空白肝郁组、普萘洛尔对照组、普萘洛尔肝郁组、逍遥散对照组、逍遥散肝郁组、GW2580空白组、GW2580肝郁组、GW2580普萘洛尔组、GW2580普萘洛尔肝郁组。流式细胞检术检测各组小鼠脾脏 M2型巨噬细胞比例，qRT-PCR检测脾脏巨噬细胞IL-1β、TNFα、CCL4mRNA表达。 结果: 1、E可显著上调THP-1细胞中β2-AR的表达，而普萘洛尔则可以抑制其表达。 2、E可显著提高M2型巨噬细胞CD206、CD163表达，并随着浓度升高，CD206蛋白表达增强，E可促进M2型巨噬细胞生成，普萘洛尔则可以抑制其作用。 3、E作用的M2型巨噬细胞可提高HCT116细胞的体外侵袭能力，普萘洛尔可逆转其促侵袭作用。并可显著上调M2型巨噬细胞MMP-2、MMP-9和VEGF的表达，普萘洛尔则可以下调其表达。 4、随着病例分期升高，淋巴结转移增多，患者CD206、β2-AR表达增多。 5、逍遥散含药血清可逆转E对于M2型巨噬细胞生成的促进作用。并可逆转E作用于M2型巨噬细胞对于HCT116细胞的促侵袭作用，并可下调M2型巨噬细胞MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。 6、通过皮下注射E法成功否建出肝气郁结模型。肝郁组小鼠5-HT、CRH分泌降低，活动时间减少，糖水偏嗜程度降低。 7、肝郁组小鼠肝脏转移灶较对照组显著增多。清除巨噬细胞后，脾脏种植瘤、肝转移瘤均减少。普萘洛尔、逍遥散可减低小鼠肝转移的程度。肝郁组与空白组相比，脾脏中M2型巨噬细胞含量明显升高。普萘洛尔、逍遥散可促进小鼠脾脏巨噬细胞分泌IL-1β、TNFα、CCL4，降低MMP-9的分泌。 结论: 1、E能促进M2型巨噬细胞生成。 2、E通过β2-AR信号通路，上调M2型巨噬细胞MMP-2、MMP-9和VEGF的表达，从而提高HCT116细胞的体外侵袭能力。 3、结肠癌患者肿瘤组织及癌旁组织中存在β2-AR激活的M2型巨噬细胞聚集，并与肿瘤的进展有相关性。 4、逍遥散含药血清、普萘洛尔可以抑制M2型巨噬细胞生成。 5、逍遥散含药血清、普萘洛尔可下调M2型巨噬细胞MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。 6、β-AR信号通路介导肝气郁结作用于M2型巨噬细胞促进结肠癌肝转移。
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