摘要
目的: 复方木尼孜其颗粒在临床上多用于皮肤科、肿瘤科和妇科的治疗，如黄褐斑、痤疮、肿瘤、盆腔炎。黄褐斑是一种色素沉着性疾病，能导致恶性黑色素瘤的发生，这些疾病的发生都与黑色素合成息息相关。而且酪氨酸酶在黑色素合成过程中起到限速酶的作用。因此，本文旨在对复方木尼孜其颗粒预防治疗恶性黑色素瘤方面的作用及潜在的作用机制进行探讨，为其临床合理用药提供理论依据。 方法: 1.采用CCK-8法检测复方木尼孜其颗粒及其提取物和β-咔啉类生物碱对黑色素瘤细胞活力的测定，采用紫外法检测复方木尼孜其颗粒及其提取物对体外酪氨酸酶活性的检测。 2.采用透射电镜、MDC荧光染色和激光共聚焦检测HAR诱导下的自噬体形成。通过Hoechst33258染色细胞核形态，流式细胞仪检测HAR诱导下B16细胞凋亡率和细胞周期。通过加入自噬抑制剂3-MA和巴弗洛霉素A1检测其对细胞活力和周期以及自噬流的影响。采用western blot检测自噬体生物标记物LC3-Ⅱ和P62的蛋白表达和自噬相关信号通路。 结果: 1.结果显示骆驼蓬子提取物(1 mg/ml)、茴香根皮提取物(4 mg/ml)、黑种草子提取物(2 mg/ml)、菊苣子提取物(10 mg/ml)、菊苣根提取物(10 mg/ml)、芹菜根提取物(4 mg/ml)、香青兰子提取物(1mg/ml)以及复方木尼孜其颗粒(60 mg/ml)与阴性空白组相比明显的抗肿瘤作用(p＜0.001)。从骆驼蓬子中提取的β-咔啉类生物碱如骆驼蓬碱(Harmaline)、HAR(Harmine)、哈尔满碱(Harmane)、哈尔醇(Harmol)，这四种单体都能显著抑制B16细胞增殖，并呈浓度依赖(p＜0.001)。其中效果最为显著的是HAR。复方木尼孜其颗粒中各提取物对酪氨酸酶的抑制作用没有明显作用，其中有黑种草子和香茅效果较显著(p＜0.001)。 2.通过透射电镜中，能观察到HAR(40μM)给药组出现自噬体。MDC染色自噬体HAR(50，60μM)给药组自噬体数量显著多于空白组(p＜0.001)，荧光显微镜观察HAR(80μM)在胞质或核周区域可见到清晰的点状结构，而且显示更强的荧光密度。自噬体标记物LC3-Ⅱ蛋白表达明显增加呈浓度依赖，而P62蛋白明显减少呈浓度依赖，以上实验说明HAR诱导B16细胞产生自噬。结果显示Annexin-Ⅴ-FITC/PI染色细胞凋亡，在HAR(40，60，80μM)作用下，B16细胞早期凋亡率从0.84％到3.85％，晚期凋亡率从5.58％到12.62％，并呈浓度依赖。Hoechst33258染色细胞核，显示HAR(80μM)细胞核变大，再结合与空白对照组比较(1.05％)，HAR(40μM) G2期细胞率为6.18％，HAR(80μM)G2期细胞率为28.62％。上述结果表明HAR诱导B16细胞产生凋亡现象。表明加入自噬抑制剂3-MA(10 mM)和HAR(40，80，100μM)组细胞活力与单独加药组比较细胞活力显著升高(p＜0.001)，之前的实验说明细胞周期G2期阻滞是细胞凋亡的原因，通过加入自噬抑制剂3-MA(5mM)细胞G2期阻滞现象也消失了。通过检测加入不同自噬抑制剂3-MA(5mM)和巴弗洛霉素A1(10 nM)后LC3-Ⅱ蛋白表达，结果说明加入3-MA联合HAR(80μM)组LC3-Ⅱ蛋白轻微减少，巴弗洛霉素A1联合HAR(80μM)组LC3-Ⅱ蛋白明显增加，说明HAR是促进自噬活性诱导自噬的，并且HAR诱导的凋亡大部分是自噬引起的。通过western blot检测HAR作用下AKT/mTOR信号通路，说明HAR通过抑制AKT/mTOR信号通路来促进自噬。 结论: 复方木尼孜其颗粒及其所含7味提取物对抗黑色素瘤有抑制作用，却对酪氨酸酶的活性没有抑制作用的。从骆驼蓬子中的β-咔啉类生物碱中，筛选出HAR是抗黑色素瘤作用中最显著的。HAR可以诱导黑色素瘤B16细胞自噬和凋亡，通过诱导自噬来影响细胞周期阻滞来促进细胞凋亡。HAR诱导下的自噬是通过增加自噬活性和抑制AKT/mTOR信号通路而得来的。
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