摘要
绒山羊的毛囊有初级毛囊(PHF)和次级毛囊(SHF)之分，分别决定着羊毛与羊绒的发育和再生。研究表明，绒山羊的毛囊发端于胎儿时期，主要成熟于胎儿时期，完成于青年羊阶段，在整个发生发育过程中具有明显的阶段性特征。绒山羊的毛囊发生与发育涉及众多关键基因，目前的主要功能基因及其互作网络尚未明确。第二代高通量测序技术，特别是RNA-seq技术的应用为绒山羊毛囊发育的分子调控研究提供了可能，目前在内蒙古白绒山羊等品种上的研究也取得了较大进展。然而，对陕北白绒山羊的毛囊发育，特别是关于毛囊发育早期的研究尚属空白。本研究旨在研究陕北白绒山羊胎儿期和羔羊期皮肤组织形态发育规律研究的基础上，重点对其胎儿期早期(E60)、中期120d(E120)和末期(NB)的皮肤毛囊进行转录组学研究与分析，进而筛选、鉴定影响胎儿期绒山羊毛囊发育的关键基因，为绒山羊毛囊周期性生长调控奠定理论基础;另外，本试验，试图在基于CRISPR/Cas9技术构建基因缺陷型毛乳头细胞(DP)模型的基础上，比较研究绒山羊毛囊关键调控基因，如维生素D受体基因（VDR）的功能，并试图通过添加外源化合物，验证关键基因的调控作用，为绒山羊的遗传改良，特别是基因编辑修饰提供技术和候选基因。取得的主要研究结果如下: 1.陕北白绒山羊胎儿期60胎龄(E60)、120胎龄(E120)和新生羔羊(NB)三个阶段观察分析其毛囊组织形态特征，发现E60时PHF的基板在头颈和体侧部已出现，且头颈部的基板深度均显著大于体侧部;至E120时PHF的结构完整且毛干已经形成，但是未长出皮肤表面。SHF大量出现，一些SHF的完整结构已经形成，还有大部分SHF结构不完整，发育不成熟;至NB时，PHF中的毛干已经长出皮肤表面，完全发育成熟。SHF的一部分此时结构完整，发育成熟，可是尚有大量结构不完整的SHF。 2.陕北白绒山羊0-160日龄公羔分八个阶段(0，7，14，28，42，56，84，160 d)观测毛囊组织形态特征，结果表明绒山羊的毛囊群多为三元型毛囊，即3个PHF，周围有若干个SHF构成一个毛囊群;0-14 d，少部分SHF结构完整，且羊绒已经长出体表，大多数SHF结构还不完整;14-84 d期间，毛囊群中SHF数量快速增加，长度变长且不断向真皮层延伸;84-160 d时绝大多数SHF的内根鞘、外根鞘等结构完整，羊绒完全长出体表。少数SHF的结构完整，羊绒还未长出体表，表明尚未成熟。 3.绒山羊E60、E120和NB阶段，采集9个胎儿皮肤毛囊样品（每个时期3个），成功构建了9个总RNA文库。经Illumina HiSeqTM2000测序，从每个文库获得的干净reads2.06千万以上。分析表明E120/E60、NB/E60、E120/NB分别有1024、1801、0个DEGs，E60、E120和NB阶段总共出现了2059个DEGs。 4.采用趋势分析方法，对上述2059个DEGs表达轨迹的聚类分析，这些DEGs聚集在8条表达轨迹上，其中1975个DEGs主要聚集在4条表达轨迹上，且可能与毛囊发育有关。进一步的GO富集分析表明，上述2059个DEGs显著富集在细胞位置、分子功能和生物过程等类别(P＜0.05)，且生物过程中属于单组织过程的有80.6％DEGs，单组织细胞过程的有69.3％DEGs、生物调节的有48.1％ DEGs。KEGG的分析表明55.5％的DEGs参与了218条信号通路，且主要是富集在癌症通路和ECM-受体相互作用信号通路上。 5.采用差异基因表达轨迹分析方法与KEGG分析方法综合分析，发现主要聚集在4条转录轨迹上的1975个DEGs中有10个DEGs被注释在ECM及其受体相互作用信号通路上，且其在E60时的基因表达量显著高于E120和NB时(P＜0.05)，说明这10个DEGs与毛囊发生有关。有10个DEGs被注释到癌症通路上，且其他通路上存在7个很重要的转录因子相关基因。这些DEGs在E120、NB时的基因表达量显著高于E60时(P＜0.05)，表明这17个DEGs可能与毛囊发育和成熟有关;同时发现，VDR基因明显与发育过程、角质形成细胞的增殖分化有关，而且VDR基因在E120和NB时的表达量极显著上调(P＜0.001)。 6.首次克隆陕北白绒山羊VDR基因完整的CDS区序列。基于此，采用实时定量PCR技术对VDR基因在绒山羊胎儿期的表达情况进行了研究，结果表明E60和E120时在9个绒山羊组织中VDR mRNA的表达差异较大，且以E120时的皮肤组织中VDR基因的表达量最高;免疫组化研究结果表明，在E120和NB时VDR蛋白在毛囊内根鞘、外根鞘和毛球部高表达。 7.基于CRISPR/Cas9技术成功构建了VDR缺陷型毛乳头(DP)细胞模型，与野生型DP细胞相比，纯合突变细胞cell-4中VDR基因的转录水平显著降低77％，VDR蛋白水平显著降低69.5％(P＜0.05)。在此基础上，通过比较VDR缺陷型DP细胞与野生型DP细胞的培养情况，缺失VDR基因CDS区之后，DP细胞增殖速度明显降低(P＜0.05)，而且IGF-1、Noggin、Lef1和b-catenin等4个基因的mRNA表达水平显著下调(P＜0.05)，说明VDR基因的缺失可能会抑制Wnt、Bmp和IGF-1信号通路，进而影响毛囊的发育; 8.野生型DP细胞中添加外源化合物，发现不同浓度的CM（姜黄素）和AA（花生四烯酸）可显著促进DP细胞的增殖(P＜0.05)，显著提高VDR基因的mRNA和蛋白表达;显著提高IGF1、Noggin、b-catenin和Lef1基因的mRNA表达(P＜0.05);同时，在VDR基因缺陷型DP细胞上发现具有类似结果，可是，当添加AA时，IGFI基因的mRNA表达没有显著变化，说明AA对于毛囊中IGF-1表达的促进作用受到VDR基因的调控。 综上所述，陕北白绒山羊在胎儿期发育至60天时已形成了PHF基板，羔羊出生时(NB) PHF已经完全成熟，可是，羔羊生后160日龄时SHF尚未完全成熟;RNA-seq转录组测序结果表明，绒山羊胎儿期VDR基因对毛囊发育成熟有重要作用;进一步的分析表明VDR基因对毛囊的DP细胞具有调控作用。
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