摘要
葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase，GDH，EC1.1.1.47)属于短链脱氢酶/还原酶(Short-chain dehydrogenases/reductase，SDRs)。它具有四个相同亚基(28.2×4kDa)，能够催化D-葡萄糖为D-葡萄糖酸内酯，同时还原NAD(P)+为NAD(P)H。近些年，GDH的研究取得了一定进展，已经应用到很多领域，例如辅酶再生、临床检测和生物燃料电池等。早期的GDH来源主要是动物新鲜肝脏，目前大部分由微生物发酵而来。国内的GDH产量还不高，主要依靠进口。 本文研究的葡萄糖脱氢酶(GDH)来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriumIWG3)的一个突变体GDH-DN46，其通过定向进化和96孔板法获得，提高了酶的热稳定性和耐碱性，不管NaCl的存在与否都不会对这种突变酶的催化活性产生影响。这种氧化还原酶在催化反应中需要依赖辅酶NAD(P)+，但辅酶价格昂贵并且稳定性差，这大大限制了氧化还原酶在工业催化方面的应用。本文以GDH的突变体GDH-DN46作为研究对象，通过构建重组质粒并在大肠杆菌中成功表达，优化表达条件提高酶的活性，研究该酶酶学性质。将其用于辅酶再生系统，用以催化合成L-叔亮氨酸。同时本论文建立了可利用仿生辅酶的GDH的高通量筛选平台，探索仿生辅酶替代NAD(P)+在工业催化方面的应用。论文的主要研究内容如下: 1.构建了在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达GDH的重组表达质粒pET28a-GDH，E.coli BL21(pET28a-GDH)的酶活可达到0.95U/mg。对重组菌的培养和诱导条件进行优化，优化后的酶活提高到1.52U/mg，比初始酶活提高了60％。 2.对GDH的酶学性质进行研究，通过研究温度对其酶活性的影响，该酶最适温度为50℃，其酶活比在30℃测量条件下的酶活提高了30％，最适pH是7.0，具有很高的耐碱性。 3.分别构建葡萄糖脱氢酶(GDH)和亮氨酸脱氢酶(LeuDH)表达质粒pET28a-GDH和pET20b-LeuDH，并将其转化到大肠杆菌E.Coli BL21中，获得双质粒表达系统E.Coli BL21(pET28a-GDH/pET20b-LeuDH)。与用亮氨酸脱氢酶全细胞催化三甲基丙酮酸(TMP)生产L-叔亮氨酸的转化率相比，双质粒表达系统全细胞催化合成的转化率提高了约三倍。 4.研究了通过定向进化筛选可利用仿生辅酶的GDH方法，建立了可利用仿生辅酶高通量筛选平台，通过研究不同染料对辅酶NADH的颜色反应，确定高通量筛选染料为氮蓝四唑(NBT)。得到优化的筛选平台配方是:Tryptone1％;Yeast extract0.5％; NaCl1％; Agar1.8％; NBT0.1mg/mL; PMS0.01mM; Kan0.05mM; IPTG0.1mM; Glucose1mM; NMN+0.05mM。通过对重组菌70℃热处理1小时，可以使胞内辅酶NADH分解，通过热处理可以有效避免显色筛选过程中胞内的辅酶NADH产生的背景干扰。
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