摘要
为了进一步地提高鱼体对磷的利用率和减少磷的排放，本实验在低磷饲料的基础上通过添加不同浓度的维生素D3（VD3）来研究黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）鱼体中与VD3代谢和功能有关的基因和VD3对slc34a2表达的影响。12周的生长实验结束后，分别取0和5000 IU/kg VD3两组黄颡鱼的肠、肾脏和肝脏组织，在提取总RNA，当RNA的质量达到测序的要求后，取等量RNA进行混合均匀，最后上机进行RNA-seq测序。这为以后探讨鱼体肠和肾脏中调控slc34a2表达的分子网络，阐明低磷饵料中添加VD3对鱼体主动吸收磷的机制奠定一定的基础。获得的结果如下： (1)黄颡鱼转录组测序结果理想，测序质量较高。经Trinity软件组装得到了64056770条 Unigenes，其中包括22665 Distinct Clusters和57796 Distinct Singletons；Unigenes的平均长度和N50分别是1100 nt和2017 nt；将Unigenes序列比对到蛋白数据库Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库的比对发现分别有43051、42791、39132、32699、15377和27848个Unigenes得到注释；通过Nr注释的黄颡鱼 Unigenes物种统计图，发现注释到最多基因的物种是斑马鱼（58.64%），表明斑马鱼的基因组可以作为黄颡鱼的参考基因组;同时，也在23865 Unigenes中发现了32206个 SSRs位点；KEGG代谢通路分析表明有32699 Unigenes被分配到了259条生物通路中。 (2)通过对黄颡鱼转录组的Unigenes筛选，得到了6个与VD3功能和代谢有关的基因，其中包括vdr, rxr, cyp27a1, cyp2r1, cyp27b1和 cyp24a1。 (3)在黄颡鱼肠和肾脏组织中克隆得到2条slc34a2基因亚型,命名为肠slc34a2a2亚型和肾脏 slc34a2b亚型，并对其 cDNA全长进行了生物信息学分析。预测黄颡鱼SLC34A2A2和SLC34A2B蛋白质序列分别与鲤鱼Cyprinus carpio（75.4%）和青鳉 Oryzias latipes（55.9%）最相似；与黄颡鱼SLC34A2A1（在我们已发表的文章中称为SLC34A2）蛋白的相似度分别达到65%和53.8%。对SLC34A2蛋白的跨膜域进行预测，发现SLC34A2A2和SLC34A2B分别有11和9个跨膜域，且蛋白的N-端和 C-端分别在胞外和胞内。多重序列比较黄颡鱼的3种SLC34A2亚型，发现在3种SLC34A2亚型中ICL-1和ECL-3非常的保守，而最大的不同是在 ECL-2， N-和 C-端的区域；在 SLC34A2A1， SLC34A2A2和SLC34A2B蛋白最大ECL-2中发现分别有6个，5个和3个N-连接糖基化位点，除此之外，在3种亚型的C-端也发现了十分保守的PDZ结合基序。与SLC34A2B蛋白相比，SLC34A2A2和SLC34A2B蛋白在C-端有一段保守的半胱氨酸序列。 (4)运用qPCR分析了slc34a2 mRNA在不同组织中的表达情况，结果表明slc34a2a2 mRNA主要在肠中表达，而slc34a2b mRNA主要在肾脏中表达，其次是肌肉和皮肤。 (5)本文也研究了在低磷饲料中添加不同剂量0,324,1243,3621,8040，27000 IU/kg的VD3对 slc34a2 mRNA表达的影响。与对照组相比，肠slc34a2a1 mRNA表达在324,1243,3621和8040 IU/kg组都没有显著性差异（p>0.05），然而在27000 IU/kg组达到了最高（p<0.05）；slc34a2a2 mRNA表达从0 IU/kg到27000 IU/kg显著性地增长（p<0.05）；而在肾脏中slc34a2b mRNA表达水平先上升，到3621 IU/kg组达到最高。由此我们可以推测在低磷的饲料中添加1243-3621 IU/kg VD3将更有利于黄颡鱼对磷的吸收利用。
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