摘要
目的： 本项目从中西医结合角度出发，利用现代分子生物学技术和免疫学理论研究由T4、GC诱导的Th1/Th2类细胞因子异常表达状态以及中药的调节作用，从分子水平探讨阴阳补益类中药的免疫调节机理及其与阴虚、阳虚的相互关系，为阴阳补益类中药用于治疗激素引起的免疫功能失调提供理论依据。 方法： 1.动物实验: 选用近交系BALB/cA雌性小鼠，分别通过肌肉注射氢化可的松(Hydrocortisone，HC)和灌胃甲状腺素(T4)两种方法诱导Th1/Th2类细胞因子异常表达的动物模型。两种动物模型在造模同时分别灌胃右归丸制剂（you-gui-wan，YGW）和左归丸制剂（zuo-gui-wan，ZGW）进行干预治疗，并且与正常对照组（正常动物灌胃生理盐水）、药物对照(正常动物灌胃YGW/ZGW)和阴性对照组（模型动物灌胃生理盐水）对照，连续处理7天，在末次处理后1h尾静脉注射小剂量ConA（生理盐水作对照）分别观察小鼠脾细胞在正常和活化状态下，激素诱导的Th1/Th2类细胞因子表达模式以及阴阳补益类中药的干预作用。首先，采用RT-pCR检测小鼠脾脏单个核细胞IFN-γ、IL-2(Th1)，IL-4、IL-10(Th2) mRNA的表达水平，以β-actin作为同步内参照，使用Alpha innotech图象分析软件对细胞因子的电泳图象进行分析，获得mRNA表达的相对密度值(RDV)，进行统计分析。其次，分别采用ELISA、流式细胞仪(FACS)胞内外因子双染色技术，检测小鼠IFN-γ+、IL-4+、IL-10+T细胞各亚群的变化以及血清中IFN-γ的含量，从基因转录、细胞因子分泌细胞和血清蛋白含量等不同层次探讨激素诱导的Th1/Th2的表达模式及阴阳补益类中药的干预效应。 2.细胞培养: 常规培养:分离中药调整前后激素处理的小鼠脾细胞在体外培养，RT-PCR检测培养体系中Th1/Th2类细胞因子的转录状态，进一步验证激素处理后T细胞应对丝裂原刺激的细胞因子表达能力的改变及中药的保护效应。另外，选用正常小鼠脾细胞，在常规培养体系中分别加入T4、T4+ZGW、HC、HC+YGW，常规培养4h后，RT-PCR法检测培养细胞IFN-γ、IL-2，IL-4、IL-10 mRNA的表达，在体外重现T4、HC诱导的小鼠Th1/Th2类细胞因子异常表达状态及ZGW、YGW制剂的调节作用。 FACS胞内外因子染色:分离中药调整前后激素处理的小鼠膊细胞，体外加入PMA、离子霉素、莫能霉素刺激培养4h后，采用FACS胞内外因子双染色技术检测细胞因子分泌T细胞亚群的变化特点，以探讨激素对Th1/Th2细胞亚群的影响和中药的保护效应。 结果： 1.GC对小鼠Th1/Th2类细胞因子表达的抑制作用及YGW的保护效应 (1).GC诱导小鼠Th1/Th2类细胞因子表达的抑制状态 小鼠给予GC处理后，可诱发小鼠出现精神萎靡、倦怠少动和内脏系数改变等“阳虚”体征。IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10 mRNA表达水平明显低于正常对照组，GC对Th1/Th2类细胞因子的转录有明显的时间和剂量依赖性抑制效应。另外，GC处理小鼠脾细胞应对Con A刺激的细胞因子表达能力亦明显减弱。 GC体外对培养小鼠脾细胞的细胞因子转录水平呈剂量依赖性抑制作用，并可削弱T细胞应对体外Con A刺激的细胞因子表达能力。随着转录水平的降低，GC处理后小鼠血清中IFN-γ含量也由210.8±26降至145.7±47(pg/ml)。提示，GC可抑制Th1/Th2类细胞因子的表达。 (2).GC对小鼠Th1/Th2细胞亚群的抑制作用 为探讨GC诱导的细胞因子异常表达是否与T细胞的变化有关，研究检测了CD4+和CD8+T细胞亚群的细胞因子表达能力，发现来源于GC处理小鼠的脾细胞中，IFN-γ+CD4+T细胞由正常状态的16.5％降至7.3％，IFN-γ+CD8+T细胞由18.6％降至6.7％，而分泌IL-4、IL-10的CD4+、CD8+T细胞的变化没有显著差异。提示GC对分泌IFN-γ的T细胞有较强的抑制作用。 (3).YGW对正常小鼠Th1/Th2类细胞因子表达的直接影响 正常小鼠给予补阳中药右归丸(YGW)治疗后，IFN-γ、IL-10、IL-2和IL-4表达水平明显高于对照组，IFN-γ、IL-10呈高水平表达，血清中IFN-γ含量(pg/ml)亦明显提高，其中大剂量YGW的促表达作用更为显著(256.8±27 vs227.8±23)，提示YGW可直接促进细胞因子的表达。 (4).YGW拮抗GC诱导的小鼠Th1/Th2类细胞因子表达抑制状态 YGW对Th1/Th2类细胞因子的表达有直接的促进作用，对GC诱导的细胞因子表达抑制状态是否有拮抗效应？研究发现，GC处理小鼠给予YGW治疗后，GC诱发的小鼠“阳虚”体征不明显，IFN-γ、IL-10、IL-2和IL-4的表达水平也明显高于GC模型组。另外，YGW可提高GC处理小鼠脾细胞ConA活化后细胞因子的产生能力。血清中IFN-γ含量也较GC处理组明显升高(181.4±25 vs145.7±47)。YGW对GC体外诱导的Th1/Th2类细胞因子转录抑制也呈现剂量依赖性保护作用。体内外实验结果说明:YGW在拈抗GC诱导的“阳虚”体征的同时，可有效保护Th1/Th2类细胞因子的表达。 (5).右归丸对Th1/Th2类细胞亚群的促增殖效应 给予GC+YGW处理后，IFN-γ+CD4+T细胞由GC处理后的7.3％升至13.8％，CD8+T细胞由6.7％升至14.5％; IL-4+CD4+T细胞由GC处理后的2.7％升至11.2％，IL-4+CD8+T细胞由2.1％升至9.8％;分泌IL-10的CD4+、CD8+T细胞也明显升高(p＜0.01)。另外，通过对淋巴细胞绝对记数的总结和分析，发现GC+YGW处理小鼠脾脏、胸腺等淋巴器官的淋巴细胞总数明显高于GC处理组，细胞因子分泌性T细胞亚群也随之扩大。结果提示:YGW对GC诱导的Th1/Th2类细胞因子表达抑制状态和Th1/Th2细胞亚群的低增殖状态具有明显的拮抗作用。 2.甲状腺素对小鼠Th1/Th2类细胞因子表达的抑制作用及ZGW的调节效应 (1).甲状腺素对小鼠Th1/Th2类细胞因子表达的抑制作用 小鼠给予T4处理后，出现体温升高、亢奋多动以及内脏系数改变等“阴虚”体征。IFN-γ、IL-10、IL-2和IL-4 mRNA表达水平明显降低，T4的抑制作用有明显的时间依赖性。另外，T4处理小鼠脾细胞经ConA刺激后，其细胞因子表达能力明显减弱。血清中IFN-γ含量(pg/ml)由正常状态的210.8±26降至158±67（P＜0.05）。T4在体外也可降低培养小鼠脾细胞的Th1/Th2类细胞因子转录水平，尤其对IFN-γ、IL-4的表达有剂量依赖性抑制作用。提示T4对Th1/Th2类细胞因子的表达有明显的抑制作用。 (2).T4对小鼠Th1/Th2细胞亚群的影响 FACS胞内外因子双染色技术检测结果显示:小鼠给予T4处理后，IFN-γ+CD4+由15.2％降至8.3％，IFN-γ+CD8+由22.2％降至8.9％，IL-10+CD4+、由7.6％降至2.3％，IL-10+-CD8+由8。6％降至1.3％。结果提示T4可明显降低T细胞中Th1、Th2细胞亚群的比例。 (3).ZGW对正常小鼠Th1/Th2类细胞因子表达的直接作用 正常小鼠直接给予ZGW治疗后，IFN-γ、IL-10、Ih-2和IL-4 mRNA表达水平明显低于未治疗组，其中IFN-γ、IL-4降低较为明显，ConA刺激的脾细胞其细胞因子表达能力也明显减弱。ZGW对体外培养小鼠脾细胞IFN-γ、IL-4的表达也有抑制效应。FACS检测结果显示:ZGW治疗小鼠IFN-γ+CD4+T细胞由12.5％降至3.6％，IFN-γ+CD8+T细胞由11.7％降至3.1％，而IL-4+、IL-10+T细胞只是轻度减少，没有显著差异。另外，大剂量ZGW可明显降低小鼠血清中IFN-γ的含量(167.6±67 vs210.8±26)。 实验结果提示:ZGW对Th1/Th2细胞因子的表达有直接的抑制作用。 结论： 激素类药物可通过降低基因转录、减少蛋白分泌和抑制细胞因子分泌性细胞的增殖等途径抑制小鼠Th1/Th2类细胞因子的表达，打破原有的Th1/Th2平衡模式，这既是发挥其免疫抑制作用的药理基础之一，也是其致病的免疫病理因素。中药阴阳补益方剂ZGW、YGW可调整激素类药物诱导Th1/Th2类细胞因子表达的抑制或失衡状态，重建Th1/Th2平衡。其中，YGW可通过促进细胞因子的表达和细胞因子分泌性T细胞的增殖等途径，逆转GC诱导的Th1/Th2类细胞因子表达抑制状态;而ZGW通过抑制细胞因子的表达调节Th1/Th2的平衡。YGW、ZGW对Th1/Th2类细胞因子的保护和平衡调控作用可能是其临床增强机体抗病能力和改善阴阳失调体征的免疫药理基础之一，这将对临床治疗与Th1/Th2类细胞因子漂移的相关疾病、改善或预防激素类药物导致的免疫功能紊乱具有重要的临床意义，同时也为阐明部分阴阳补益类中药的免疫药理基础提供理论基础和实验依据。
NETL