摘要
琥珀酸是一种重要的平台化合物，琥珀酸及其衍生物被广泛地应用于食品、医药和化工等领域。大肠杆菌是目前生产琥珀酸的主要菌株。然而由于胞内NADH的供应不足，大肠杆菌经TCA还原臂生成琥珀酸的最大理论得率被限制为1 mol/mol葡萄糖。本文首次计算并报道出当磷酸戊糖(PP)途径和糖酵解途径的碳流量比为6:1时，琥珀酸能实现其最大理论得率1.714 mol/mol葡萄糖。基于这个理算计算，我们战略性地调控了产琥珀酸的多条途径。系统的代谢工程策略，包括过表达氧化PP途径的关键基因，强化葡萄糖的运输效率，过表达羧化途径的关键酶，以及强化琥珀酸胞内到胞外的运输，琥珀酸的得率提高到1.54 mol/mol葡萄糖，相比出发菌株ZTK提高了52%，达到理论最大得率的90%。 来自谷氨酸棒杆菌的解调基因zwf243-gnd361被首次引入大肠杆菌的琥珀酸生产菌株ZTK。通过比较过表达大肠杆菌自身的zwf-gnd和谷氨酸棒杆菌的突变基因zwf243-gnd361对琥珀酸得率及胞内NADH/NAD+的影响，发现过表达来自谷氨酸棒杆菌的解调基因zwf243-gnd361能有效地提高胞内 NADH的水平，促进琥珀酸的合成。进一步过表达了PP途径的关键基因pgl、talB和tktA，琥珀酸的得率提高到1.21 mol/mol葡萄糖。引入产琥珀酸放线杆菌的pepck，过表达大肠杆菌自身的sthA，敲除乙酸形成基因ackA-pta，菌株WSA150琥珀酸得率提高到1.36 mol/mol葡萄糖。在菌株WSA150的基础上，过表达葡萄糖运输途径的基因galp，菌株的比糖耗速率提高了12%。过表达来自谷氨酸棒杆菌的pyc，副产物丙酮酸的积累量减少将近一半，琥珀酸的得率提高到1.40 mol/mol葡萄糖，达到理论最大得率的82%。 我们进一步强化厌氧条件下的四碳二羧酸运输蛋白的表达量从而去提高琥珀酸的得率。结果表明只过表达 dcuB，琥珀酸的得率上升到1.53 mol/mol葡萄糖，达到理论最大得率的89%。只过表达dcuC，琥珀酸的得率上升到1.46 mol/mol葡萄糖，达到理论最大得率的85%。同时过表达dcuB和dcuC，琥珀酸的得率上升到1.54 mol/mol葡萄糖，较出发菌株ZTK提高52%，达到理论最大得率的90%。最后在过表达dcuB的基础上敲除基因zwf243-gnd361前面的阻遏蛋白结合位点，摆脱诱导剂IPTG的诱导，菌株比生长和比糖耗速率分别提高63%和13%，琥珀酸的得率为1.50 mol/mol葡萄糖，占理论最大得率的88%。本研究中描述的系统代谢工程策略同样也适用于在大肠杆菌中合成其他NADH依赖型的产品。
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