摘要
2002年至2003年期间，中国及其周边地区爆发的重症急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome，SARS)，俗称非典型肺炎，是一种急性呼吸道传染病，它起病急、传播快，死亡率大约10％左右。导致SARS的病原体是一种被称为SRAS冠状病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV)的冠状病毒变异体，它的基因组编码复制酶多聚体蛋白、棘突蛋白(Spike protein)、包膜蛋白(Envelope protein)、基质膜蛋白(Membrane prtein)及核衣壳蛋白(Nucleocaspid protein)等几种主要的结构蛋白。同时在临床中发现SARS-CoV自然感染后可以获得抗病毒免疫。这些发现为人工免疫防治SARS奠定了基础。 本实验室于2003年6月在深圳市科技局科技攻关项目的支持下，开展了SARS基因工程重组疫苗的研究。在研究初期，构建了SARS-CoV的几个结构蛋白S蛋白、N蛋白、M蛋白及E蛋白的重组亚单位疫苗和核酸疫苗，并在小鼠实验中检测它们的免疫效应，为进一步的疫苗研究提供依据。本论文报道了S蛋白的重组蛋白疫苗和核酸疫苗的构建及其对小鼠的免疫效应。 S蛋白是SARS-CoV入侵宿主细胞，引起宿主的免疫反应及中和抗体产生的主要蛋白，是SARS疫苗研究中的一个最重要的靶蛋白。S基因全长3768bp，编码1255个氨基酸，结构上分为N端的球状结构域S1和C端的棒状结构域S2，S1识别并结合宿主细胞膜上的受体，S2参与病毒外膜与宿主细胞膜的融合。根据S蛋白的抗原表位分析结果，本课题选择了抗原表位富集的两段序列S1（108-488位氨基酸）和S2（724-938位氨基酸）进行研究。 本研究工作分为以下三个部分: 一 SARS冠状病毒S1和S2重组蛋白多克隆抗体的制备 从SARS-CoV培养液中提取SARS-CoV基因组，RT-PCR扩增S、S1和S2基因，克隆到pMD18-T载体测序，结果与Genbank登陆序列一致。BamHⅠ和SalⅡ限制性内切酶消化后克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2，转化入大肠杆菌JM109。经IPTG诱导后重组细菌表达了GST-S1和GST-S2融合蛋白。裂解细菌，用GSH-Sepharose亲和层析纯化S1和S2重组蛋白。纯化的蛋白可以被SARS恢复期患者血清识别，保持了它们的免疫原性。50μ g纯化蛋白与完全福氏佐剂混合，免疫NIH小鼠三次，在小鼠血清中检测到高滴度的特异性抗体。 二 SARS冠状病毒重组S1和S2蛋白对Ba lb/c小鼠的免疫效应 把SARS-CoV的S、S1和S2基因克隆到原核表达载体pET-23a中，转化入大肠杆菌BL21(DE3)(plyS)，IPTG诱导重组蛋白表达。利Ni2+金属鳌和层析纯化重组S1和S2蛋白，可以被SARS恢复期患者血清和制备的抗S1或S2多克隆抗体识别。纯化蛋白皮下免疫Balb/c小鼠，产生了高滴度的特异性抗体。进一步分析抗体亚型表明S1免疫小鼠产生的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的滴度分别为1∶12800、1∶12800、1∶12800和1∶1600，S2免疫小鼠产生的四种抗体亚型滴度分别1∶12800、1∶12800、1∶6400和1∶400。蛋白免疫组和对照组小鼠血清中细胞因子的浓度无显著差异。免疫小鼠脾脏CD8+T细胞明显增高，而CD4+T细胞比例无显著变化。这些结果说明重组的S1和S2蛋白可以刺激小鼠产生较强的体液免疫应答和明确的细胞免疫应答。 三 SARS冠状病毒重组S1和S2基因DNA疫苗对Bal b/c小鼠的免疫效应 把SARS-CoV的S1和S2基因克隆到真核表达载体pVAC中，转化入大肠杆菌DH5α。提取质粒瞬时转染HEK293细胞，RT-PCR和Western-blot检测转染基因的表达。通过基因枪皮内免疫和肌肉注射免疫两种途径接种Balb/c小鼠三次。基因枪免疫小鼠不能检测到抗S1或S2的抗体的产生，血清中细胞因子也难以检测到，但免疫小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞明显增高。肌肉注射免疫小鼠第三次免疫后抗S1和抗S2的抗体达到1∶3200，进一步分析抗体亚型发现S1免疫小鼠产生IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的滴度分别为1∶3200、1∶3200、1∶3200和1∶200，S2免疫小鼠产生的四种抗体亚型滴度分别1∶800、1∶3200、1∶3200和1∶1600。免疫组和对照组小鼠血清细胞因子浓度也无显著差异。免疫组小鼠脾脏CD8+T细胞明显升高，CD4+T细胞无显著改变。结果表明不同免疫途径对DNA疫苗免疫效果的影响很大，pVAC-S1/S2重组质粒通过两种方式免疫小鼠均可诱导细胞免疫应答，肌肉注射免疫比基因枪免疫更容易诱导体液免疫应答。 本课题研究获得以下结论:重组S1和S2蛋白免疫小鼠可以诱导高滴度的抗体产生和细胞免疫应答。S1和S2的DNA疫苗通过不同途径免疫小鼠产生的效果差异很大，肌肉注射比基因枪免疫更好。在小鼠中蛋白免疫比DNA免疫诱导的体液免疫应答效果更好。
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