摘要
肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长发育的负调控因子，该基因突变使个体表现为“双肌”表型。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除绵羊MSTN基因，成功制备基因编辑绵羊，为未来的绵羊种质创新提供了素材。 (1)CRISPR/Cas9-MSTN-gRNA的设计及活性验证:从绵羊MSTN基因CDS筛选出10个靶向位点，对其中4个靶向位点构建Cas9/gRNA，并在体外环境验证活性后得到最高体外切割效率(55％)的MSTN-gRNA-1靶向位点。 (2)精子来源对卵母细胞体外受精效果的影响:附睾鲜精和冻精卵裂率分别为85.03％、7125％，附睾鲜精卵裂率显著高于冻精(P＜0.05)。附睾鲜精和冻精桑囊率分别为4874％、3176％，附睾鲜精显著高于冻精(P＜0.05)。结果表明，绵羊体外受精受精子类型影响较大，采用附睾鲜精可获得理想卵裂率和桑囊率。 (3)精卵共培养时间(18h、221h、24h、26h)对卵母细胞体外受精效果的影响，精卵共培养18h、22h、24h、26h卵裂率分别为55.13％、83.06％、81.09％、7391％，22小时与18h差异性极显著(P＜0.01)，与26h差异性显著(P＜005)，与24h差异性不显著(P＞05)。精卵共培养18h、22h、24h、26h桑囊率分别为27.91％、4466％、35.33％、2823％，22小时与18h、24h、26h均差异性显著（P＜0.05）。结果表明，22h卵母细胞体外受精较好。 (4)不同时间(9h、10h、11h、12h)注射外源RNA对胚胎发育的影响:9h、10h、11h、12h的卵裂率分别为42.95％、32.26％、20％、13.56％，9h与11h、12h差异性极显著(P＜001)，与10h差异性显著（P＜0.05）。9h、10h、11h、12h的桑囊率分别为37.50％、14.44％、087％、12.5％，9h与10h、11h、12h均差异性极显著（P＜0.01）。结果表明，精卵共培养9h进行1细胞受精卵注射较好。 (5)注射不同浓度的外源RNA对胚胎发育的影响:浓度①(Cas9:50ng/ul，gRNA.25ng/uL)、②(Cas9:25ng/uL，gRNA:12.5ng/uL)、③(Cas9.12.5ng/uL，gRNA:6.25ng/uL)的的卵裂率分别为41.67％、57.25％、59.09％，②与①差异性显著(P＜0.05)，与③相比卵裂率降低，但差异性不显著(P＞005)。①、②、③的桑囊率分别为20％、3797％、38.46％，②与①差异性极显著(P＜001)，与③相比，桑囊率有所下降，但差异性不显著(P＞0.05)。结果表明，为达到卵裂率及桑囊率高的效果，③浓度较好。 (6)绵羊胚胎中gRNA-Cas9切割效率验证:采用注射浓度Cas9:12.5ng/uL，gRNA6.25ng/uL时，gRNA-Cas9mix(mRNAmix)对绵羊胚胎MSTN基因切割效率为23.5％。 (7)注射后的胚胎发育到囊胚后，经胚胎移植后与2016年10月得到敲除MSTN基因的绵羊。
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