摘要
氮肥是获得作物高产的重要保障之一。施入土壤中的氮肥通常以NH4+-N（如水稻田）或NO3--N（好氧，旱地）形式存在。生产中所用的氮肥大多数为铵态氮肥（如尿素可在土壤中脲酶的作用下迅速分解为NH4+-N形式）。南方水稻田中施用的氮肥因其厌氧和偏酸性的土壤环境不利于硝化作用的进行而以铵态氮的形式在一段较长的时期内存在于土壤中;即便是在旱地土壤中，因氮肥的追施多采用集中施用的方式而使得在追肥的短时间内，铵态氮在施肥点附近集中存留。因此，作物对铵态氮的有效吸收也是氮肥高效利用的重要环节之一。 通过铵、硝供应下的水培试验，明确了玉米虽为旱地作物，也可高效利用铵态氮的现象，且其对铵的吸收、积累随供铵浓度的增加逐步增加。而典型喜铵作物水稻则在较高浓度铵供应下，出现较明显的自调控现象:植株氮素积累（含氮量）不随供铵浓度的增加而提高。因此本文针对玉米（持续吸铵型）和水稻（节制吸铵型）这两种不同的铵吸收利用类型，进行了进一步研究，以期为揭示其氮素高效利用机制提供线索。鉴于对旱地作物铵的吸收利用方面并未引起足够的重视，玉米方面的工作以刻画其铵吸收、利用特征作为重点;而在喜铵作物水稻中，则着重针对其在铵吸收方面的自调控现象，尝试超表达根系中的铵吸收基因OsAMT1;2在促进吸铵方面的作用。 本文的主要研究结果如下: (1)通过水培试验模拟NH4+-N或NO3--N（浓度均为1mmol/L）主导的氮素营养环境，比较测定了水稻（5个品种）、豆类（3个品种）、番茄、烟草、小麦、大麦和玉米的生长情况和氮素积累（含氮量）指标。验证了水稻为传统的喜铵作物，而豆科、番茄和烟草则偏好于硝态氮;较为意外的是，铵态氮对玉米、小麦和大麦生长的影响效果与硝态氮接近，也就是说，这些旱地作物也可高效吸收、利用铵态氮。 (2)进而以玉米为代表，通过水培试验、非损伤微测技术及基因表达试验研究了其铵吸收的特征。在单一供应铵态氮或者硝态氮（浓度均为1mmol/L）条件下，两种氮源均可对玉米幼苗的生长提供极显著的促进作用且植株含氮量较无氮处理虽有1.5-2倍的提高，但铵、硝处理之间并无显著差异。表明在吸收效率（含氮量）和对玉米植株生长的支撑作用方面，铵与硝可发挥相近的效果，玉米也可高效利用铵态氮源。为了进一步了解玉米的铵吸收特征，通过非损伤微测技术测定了同批玉米幼苗根系铵的吸收动力学。结果表明，玉米幼苗根系铵吸收过程呈典型的高亲和吸收特征（表观Km值约为60μmol/L），推测这一过程是由高亲和的转运体蛋白介导的。氮饥饿预处理使根系的铵吸收速率Vmax和Km值分别降低了约3倍和1倍。这一现象与以往在水稻中报道的氮饥饿诱导铵吸收的现象不同，暗示玉米的铵吸收过程可能不存在自调节或反馈抑制现象。另外，介质中硝态氮的存在对根系的铵吸收具有显著抑制作用（抑制效果＞20％）;在供试微摩尔浓度范围内，根系对NO3-(100μmol/L)的吸收速率显著低于对相同浓度NH4+的吸收。由于植物中铵的吸收是由AMT蛋白的功能介导的，进一步通过实时定量PCR技术对玉米根系中AMT基因的表达作了初步研究。发现玉米根系中的铵吸收基因ZmAMT1;1a和ZmAMT1;3的表达量受供铵状态的显著诱导，而在供硝或缺氮情况下，表达量显著降低。这与根系铵吸收的非损伤测定结果相一致，可能预示着玉米根系中存在一套有利于高效吸铵的系统。在低NO3-浓度下，该系统对铵态氮的高效吸收可作为其获取足够氮源的一个重要补充机制;而在NO3-供应充足的情况下，铵的吸收则受到抑制，以避免铵硝吸收利用系统在功能上的冗余。 鉴于水稻在铵吸收方面的“自调控”现象，在实验室前期工作的基础上选择了在根系中特异性表达且受供铵状态诱导的OsAMT1;2，尝试了在蛙卵中表达该吸铵基因，试图获得其功能及调控等方面的特征;进而通过在水稻中超表达该基因，分析其对进一步提升水稻吸铵能力的实际效果。 (3)利用非洲爪蟾卵母细胞为表达系统，分别采用5N同位素吸收实验、TEVC技术，对OsAMT1;2的功能进行了研究。15N同位素标记蛙卵实验表明，注射OsAMT1;2与对照H2O的蛙卵的15N的净吸收速率基本持平，说明OsAMT1;2可能无法借助蛙卵这个异源表达载体行使吸收铵的功能。另一方面，通过将有铵介导的电流产生OsAMT1;3的结构序列与无电流产生的OsAMT1;2的进行重组置换到构建各种突变体，进行TEVC电生理检测，结果显示，OsAMT1;2及所构建的各OsAMT1;2突变体均不能在非洲爪蟾卵母细胞这一异源表达系统中表达并产生铵介导的电流。联系在酵母里OsAMT1;2有铵吸收的功能，猜测可能跟磷酸化有关，即蛙卵中缺少使其发挥作用的某些因子，这将有待进一步深入的研究。 (4)OsAMT1;2超表达水稻株系在不同施氮水平下的小区试验结果初步表明，超表达株系的生物量与野生型没有显著差异甚至较弱，且单株穗重及单株饱满稻粒重较野生型显著降低，但是在主要功能叶（剑叶、倒二叶）的含氮量、游离铵含量、叶绿素含量及光合能力等指标上超表达株系有优势，这可能跟超表达株系光合功能期较野生型长有关，另外其分蘖数显著增多，这些特性对产量来说有一定优势;但这一优势并没有体现在生物量和籽粒产量的增量上。上述结果预示，水稻中众多的AMT系统之间可能存在某种协同关系，且吸氮吸收能力的提高需于相应的光合碳同化能力协同匹配，方可实现氮素利用率与产量效应的协同高效。 综上所述，本文针对玉米和水稻在铵态氮吸收利用中的不同特点，初步揭示了持续吸铵型作物玉米的铵吸收特征及其相关机制;针对水稻中的“节制性”铵吸收现象，尝试了调控根系中的铵吸收基因OsAMT1;2对水稻生长、氮素吸收利用和产量的实际效果，初步表明单一调控某个AMT基因可能达不到预期效果，需综合考虑AMT系统之间以及C/N过程之间的协同高效。
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