摘要
目的： 1.探究SIRTs家族各成员在糖尿病肾病中的表达模式，明确Sirt1-7各亚型是否参与糖尿病肾病的发生与发展以及足细胞的损伤。 2.阐明Sirt6在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用。 3.探讨Sirt6改善糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制。 方法： 第一部分:SIRTs家族各成员在糖尿病肾病中的表达模式 1.1 在糖尿病肾病小鼠肾脏皮质中检测SIRTs家族各成员的表达变化: 通过单肾切除后腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ）构建糖尿病肾病小鼠模型模型。利用蛋白免疫印迹(Western blot，WB)检测Sirt1-7在糖尿病肾病小鼠肾脏皮质中蛋白表达变化。 1.2 利用临床标本探究Sirt6在足细胞损伤相关肾病病人肾活检标本中的蛋白表达情况及其与肾小球率过滤(glomerular filtration rate，GFR)、蛋白尿的相关性分析。 1.3 在体外培养的人源足细胞(human podocyte，HPC)中检测不同刺激下Sirt6的蛋白表达变化: 体外培养人源足细胞，分别给予高糖（high glucose，HG）和糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGE)刺激24小时后，抽提细胞内蛋白，进行蛋白免疫印迹分析，检测在不同刺激下Sirt6在HPC中的蛋白表达变化。 第二部分:Sirt6在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用 2.1 足细胞特异性敲除Srit6的小鼠的构建及表型观察: 利用Cre-Loxp系统构建足细胞特异性敲除Srit6的小鼠，通过鼠尾DNA提取后的基因型鉴定确证特异性敲除小鼠的构建成功;接下来利用免疫荧光双标法进一步观察敲除小鼠肾脏石蜡切片中足细胞内Sirt6的蛋白表达水平;另外，利用肾小球分离技术对敲除小鼠进行肾小球分离，然后采用蛋白免疫印迹检测肾小球内Sirt6的蛋白表达水平，进一步在蛋白水平上对Sirt6敲除效率进行评价。 2.2 敲除足细胞Sirt6对糖尿病肾病小鼠足细胞以及蛋白尿的影响: 首先取小鼠血清及尿液进行分析，比较糖尿病肾病基因敲除小鼠与野生型小鼠蛋白尿水平的差异。利用过碘酸雪夫氏染色观察不同处理组基因敲除小鼠与野生型小鼠肾小球形态学差异。利用电子显微镜对不同处理组基因敲除小鼠与野生型小鼠足细胞形态进行观察。 2.3 体外研究Sirt6对高糖(HG)刺激下的足细胞的保护作用: 体外研究中，利用Sirt6腺病毒转染HPC，实现HPC内Sirt6蛋白高表达。首先通过荧光实时定量RT-PCR检测在HG刺激下，过表达Sirt6对HPC中炎症相关因子IL-1β、IL-6和TNFαmRNA水平的影响。 第三部分:Sirt6改善糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制 3.1 检测足细胞内Sirt6对H3K9位点的乙酰化水平的调控: 免疫组化方法观察糖尿病肾病病人以及局灶性节段性肾小球硬化症病人的肾活检标本中H3K9乙酰化水平的变化。免疫荧光双标实验继续观察足细胞敲除Sirt6糖尿病肾病小鼠足细胞内H3K9乙酰化水平的变化。体外研究中，利用蛋白免疫印迹方法检测过表达Sirt6后对HG刺激下HPC中H3K9ac的影响。 3.2 足细胞内Sirt6对Notch1和Notch4及下游靶基因HES1和Snail1表达水平的调控: 利用基因芯片筛选Sirt6的下游靶基因，通过荧光实时定量RT-PCR进一步确认过表达Sirt6后对HG刺激下HPC中Notch1和Notch4的mRNA水平的调控。利用蛋白免疫印迹的方法观察敲除HPC内的Sirt6后，Notch1和Notch4的蛋白水平是否发生上调。 3.3 足细胞中Sirt6通过调控H3K9的乙酰化水平影响Notch1和Notch4转录: 采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)方法检测Notch1和Notch4启动子是否位于H3K9位点，同时观察过表达Sirt6后对HG刺激下HPC中Notch1和Notch4启动子区域H3K9位点乙酰化水平的调控。利用ChIP方法检测Sirt6与Notch1和Notch4启动子区域是否存在结合以及它们之间的结合在不同刺激下是否发生改变。 结果： 第一部分:SIRTs家族各成员在糖尿病肾病中的表达模式 1.1 在糖尿病肾病小鼠肾脏皮质中Sirt1和Sirt6蛋白水平明显下降: 蛋白免疫印迹结果表明在糖尿病肾病小鼠肾脏皮质中，Sirt1，Sirt3，Sirt4和Sirt6蛋白表达水平出现不同程度的降低，其中以Sirt1和Sirt6下降最明显。 1.2 Sirt6在足细胞损伤相关肾病病人肾活检标本中的表达都出现明显下调，并且与肾小球率过滤、蛋白尿的生成密切相关。 1.3 在不同刺激下的HPC中，Sirt6蛋白表达水平都显著降低: 蛋白免疫印迹表明，HG与AGE都可以显著诱导HPC中的Sirt6蛋白表达水平显著下调。 第二部分:Sirt6在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用 2.1 足细胞特异性敲除Srit6的小鼠的构建及表型观察: 鼠尾DNA提取后的基因型鉴定确证足细胞特异性敲除小鼠的构建成功;免疫荧光双标实验进一步确认敲除小鼠足细胞内Sirt6的蛋白表达明显降低;蛋白免疫印迹结果发现肾小球内Sirt6的蛋白表达水平显著下调。 2.2 敲除足细胞内Sirt6加重糖尿病肾病小鼠足细胞损伤: 敲除足细胞内的Sirt6可以使糖尿病肾病小鼠蛋白尿水平进一步上升，加重肾小球系膜增生、足细胞足突的融合、足突数量的减少及肾小球基底膜的增厚。同时研究发现敲除Sirt6会进一步下调糖尿病肾病小鼠足细胞内Nephrin，Podocin蛋白表达水平，上调uPAR的蛋白表达水平。 2.3 Sirt6通过多重保护作用改善足细胞损伤: 体外研究发现过表达Sirt6可以抑制HG刺激足细胞所引起的IL-1β等炎性相关因子水平的升高，降低足细胞凋亡，改善足细胞骨架重排。另外，我们还发现Sirt6可以显著恢复足细胞内的自噬水平，抑制HG刺激所引起的自噬水平的降低。 第三部分:Sirt6改善糖尿病肾病足细胞损伤的作用机制 3.1 足细胞内Sirt6可以调控H3K9位点的乙酰化水平: 免疫组化结果发现糖尿病肾病病人以及局灶性节段性肾小球硬化症病人的肾活检标本中H3K9位点乙酰化水平明显升高。免疫荧光实验显示足细胞敲除Sirt6后会进一步上调糖尿病肾病小鼠足细胞内H3K9位点的乙酰化水平。另外，蛋白免疫印迹结果表明过表达Sirt6后可以显著的下调HG刺激足细胞所引起的H3K9ac水平的升高。 3.2 Sirt6可以反向调控Notch1和Notch4及下游靶基因HES1和Snail1的表达: 基因芯片结果提示Sirt6蛋白水平的下调可能参与HG刺激的足细胞内Notch信号通路的激活。荧光实时定量RT-PCR进一步确认过表达Sirt6后可以抑制HG刺激HPC中Notch1和Notch4的mRNA水平的上调。体外研究发现敲低HPC内的Sirt6后，Notch1和Notch4的蛋白水平显著上调;体内研究进一步确认足细胞特异性敲除Sirt6后，糖尿病肾病小鼠足细胞内Notch1和Notch4的蛋白水平明显升高。 3.3 Sirt6通过调控H3K9位点乙酰化水平影响Notch1和Notch4转录: 首先ChIP结果发现HG刺激下HPC中Notch1和Notch4启动子区域H3K9位点乙酰化水平出现明显升高，过表达Sirt6可以抑制H3K9位点乙酰化水平的上调。其次，我们通过ChIP研究发现Sirt6与Notch1和Notch4启动子区域存在结合，这种结合在HG刺激下明显减少，过表达Sirt6后能够得以恢复。 结论： 1.Sirt6的水平在足细胞损伤肾病病人肾脏中出现明显下降，并且相关性分析发现Sirt6的mRNA水平与病人肾小球滤过率呈正相关，与蛋白尿水平呈负相关。 2.特异性敲除足细胞内的Sirt6后显著加重糖尿病肾病小鼠足细胞的损伤以及蛋白尿的生成，并进一步发现Sirt6可以通过抗炎症、抗凋亡、抑制足细胞骨架重排及提高足细胞自噬水平作用改善HG诱导的足细胞损伤。 3.在Sirt6足细胞保护作用机制的研究中，发现Sirt6可以通过降低H3K9位点的乙酰化水平，抑制Notch家族中Notch1和Notch4的转录及下游信号通路的激活，继而发挥足细胞保护作用 4.本实课题首次发现Sirt6可以通过靶向调控Notch信号通路改善糖尿病肾病中足细胞损伤，降低蛋白尿的生成，为Sirt6下游作用机制提供新的思路，同时为寻找糖尿病肾病提供了新的治疗靶点与实验基础。
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