摘要
背景及目的: 脓毒症(sepsis)是宿主对感染的反应失调而引起的危及生命的器官功能障碍，是由于感染引起的全身过度炎症反应、免疫失衡、内皮损伤等因素致使细胞和组织受损，而产生多脏器功能不全的危重症。其发病率高、住院费用高、死亡率高，是一种全球性疾病负担。 在脓毒症的炎症反应、免疫失衡过程中巨噬细胞起关键作用，巨噬细胞的损伤与激活是机体发生失控性炎症反应的根本环节。巨噬细胞可分化为具有不同生物学特征的M1型和M2型两类。其中M1型巨噬细胞由干扰素γ(IFN-γ)和或脂多糖(LPS)诱导，表现为低表达甚至不表达白介素(IL)-10，并且分泌大量的促炎因子如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及趋化因子配体2（CCL-2），参与急性促炎反应，清除入侵病原体和肿瘤细胞。M1表型巨噬细胞主要发挥针对病原微生物的炎症反应和发挥宿主的免疫防御功能，也会造成机体损伤。M2型巨噬细胞由IL-4或IL-13诱导，表现为IL-10高表达，并分泌大量的抑炎因子如精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受体(CD206)、症区分子1（FIZZ-1）、几丁质酶3样分3(Ym1)，参与杀伤细胞外病原体、碎片清除、组织修复和伤口愈合。M2型巨噬细胞表现出很强的抗炎活性，对于修复和重塑炎症后期由病原微生物造成的组织损伤以及重建组织稳态中作用重大。 巨噬细胞的分化可以根据环境因素发生逆转。接受不同的刺激，不仅能使尚未分型的成熟巨噬细胞发生分型极化，而且能使已分化的M1型和M2型巨噬细胞之间可以相互转化，能使激活的M1型转化成M2型巨噬细胞，也能使M2型转化成M1型巨噬细胞，这取决于M1型和M2型标志蛋白表达量的可逆性转化。M1型巨噬绌胞标志蛋白包括表达CCL-2、IL-6和TNF-α等，而M2型巨噬细胞标志蛋白有CD206、Arg-1、IL-10、Ym-1、FIZZ-1等。M1型巨噬细胞主要参与炎症产生的起始和维持，M2型巨噬细胞主要参与炎症控制，M2型巨噬细胞数量的增加有利于炎症的消除。巨噬细胞向何种表型极化决定了炎症的最终转归。 间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)具有免疫调节、抗炎作用和旁分泌特性，被广泛用于免疫调节失衡导致的炎症性相关疾病的治疗。并且大量的研究主要围绕在与T淋巴细胞的相互作用及免疫机制方面的探讨。近年来有研究表明MSCs可改善内毒素注射及盲肠结扎穿孔导致的脓毒症动物模型损伤。我们既往研究“骨髓间充质干细胞对盲肠结扎穿孔所致脓毒痘动物模型治疗作用的研究”中也同样发现脓毒症动物模型TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平增高，IL-10mRNA表达水平降低;血清中炎症因子TNF-α、IL-6和CCL-2水平增高，抗炎因子IL-10水平降低，肺组织水肿，肺间质血管扩张、充血，肺泡间隔内可见中性粒细胞，肺泡结构破坏，在小气管、细支气管周围可见大量淋巴细胞浸润，肺组织炎症损伤重。经MSCs治疗后TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平降低，IL-10mRNA表达水平增高，血清中TNF-α、IL-6和CCL-2水平下降，IL-10升高，肺组织结构尚可，肺泡结构无明显破坏，小气管、细支气管周围可见少量淋巴细胞浸润，肺组织的炎症损伤明显减轻，72h存活率明显提高。提示MSCs对脓毒症动物模型有保护作用，并且可能是通过影响巨噬细胞起作用。 因此我们基于这些认识:1.脓毒症中巨噬细胞起关键作用。巨噬细胞可以分化为M1/M2型巨噬细胞，M1型巨噬细胞标志蛋白包括CCL-2、IL-6和TNF-α等，M2型巨噬细胞标志蛋白有CD206、Arg-1、IL-10等。发生脓毒症时M1型巨噬细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-6水平升高，M2巨噬细胞分泌的抑炎因子IL-10等水平下降。2.巨噬细胞具有可塑性，接受不同的刺激不仅能使尚未分型的成熟巨噬细胞发生分型极化，而且已分化的M1型和M2型巨噬细胞之间可以相互转化，能使激活的M1型巨噬细胞转化成M2型巨噬细胞，也能使M2型巨噬细胞转化成M1型巨噬细胞，这取决于M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞标志蛋白表达量的可逆性转化。3.MSCs对脓毒症动物模型有保护作用，可以降低全血中TNF-α、IL-6和CCL-2mRNA表达水平，同时也可以降低血清中促炎因子TNF-α、IL-6蛋白表达水平，增加抗炎因子IL-10 mRNA表达水平，提高血清IL-10蛋白水平，此外，MSCs还可以减轻组织的炎症反应、保护脏器功能，从而提高动物存活率。因此我们推测MSCs可能对巨噬细胞极化有影响，通过影响巨噬细胞的极化而抑制炎症因子的表达水平、增加抗炎因子的表达水平，从而减轻组织的炎症反应，保护脏器功能。 MSCs对巨噬细胞的作用的相关研究不多。有研究发现MSCs在体外与未极化巨噬细胞共培养后可使其具有M2型巨噬细胞的特点，M2型巨噬细胞比例上调，CD206表达上调，IL-10表达增加，TNF-α明显降低，提示MSCs调控巨噬细胞表型向M2型巨噬细胞转化，由组织促炎反应向抗炎反应调节，进而改善失控性炎症反应。然而MSCs对已经极化的巨噬细胞（M1/M2型巨噬细胞）是否有影响，是否可以促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，对M2型巨噬细胞是否有影响，这方面的相关研究尚未发现。骨髓间充质干细胞(BMSCs)相比其他类型的干细胞在培养中更容易获得并且能够迅速增殖。鉴于此，本研究利用TranswellTM培养体系，探讨BMSCs对M1/M2型巨噬细胞极化的影响。 方法: 第一部分 探索M1/M2型巨噬细胞极化体系:用不同剂量脂多糖(LPS)、干扰素γ（IFN-γ）刺激J774.1巨噬细胞24h诱导为M1型巨噬细胞;白细胞介素-4（IL-4）刺激J774.1巨噬细胞24h诱导为M2型巨噬细胞。 第二部分 1.提取SPF级C57BL/6J小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)、鉴定BMSCs表面标记物及成骨成脂诱导鉴定。 2.将已经提取的BMSCs分别与M1/M2型巨噬细胞共培养24h后,收集巨噬细胞和上清液，用实时定量PCR和ELISA检测巨噬细胞白细胞介素6（1L-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、趋化因子配体2(CCL2)、CD86、精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受体/CD206（MR/CD206）、IL-10、炎症区分子1(found in inflammatoryzone1，FIZZ1)、几丁质酶3样分子3（chitinase3-like3，Ym-1）的变化。 结果： 第一部分 1.M1型巨噬细胞诱导极化的体系为100ng/mL LPS+30ng/mL IFN-γ，100ng/mL lL-4为M2型巨噬细胞诱导极化的最适体系。 2.M1型巨噬细胞细胞表面标记为CD86，M2型巨噬细胞表面标记为CD206。 3.M1型巨噬细胞表达的特异因子有IL-6、iNOS、TNF-α、CCL-2和CD86，M2型巨噬细胞特异表达的因子有Arg-1、CD206、FIZZ-1、Ym1和IL-10。 4.经LPS和IFN-γ刺激诱导的M1型巨噬细胞形态为:巨噬细胞伸出伪足增多，呈树突状、梭状及放射状，表现为炎症性巨噬细胞形态;而经IL-4刺激诱导的M2型巨噬细胞形态为:大部分巨噬细胞细胞体积略变大呈椭圆形，细胞黏附性增强，呈聚集或集落样生长，且胞质丰富。 第二部分 1.第3代BMSCs贴壁生长，形态类似成纤维细胞，细胞表面标记物流式鉴定，结果为CD44、CD90阳性;CD45、CD34阴性，符合国际上对BMSCs的流式标记物认定标准。并且将第3代BMSCs成脂诱导3天后可见明显增多的脂滴，7天时出现大量脂滴，油红O染色成亮红色。将第3代BMSCs成骨诱导后细胞局部出现聚集现象，诱导第7天细胞呈铺路石状汇集现象，碱性磷酸酶染色呈阳性，诱导21天细胞周围有钙沉积，茜素红染色，可见红色钙结节。表明培养的BMSCs分化能力很强。 2.BMSCs分别与M1/M2型巨噬细胞共培养后发现棒状、放射状以及树枝状形态的巨噬细胞明显减少，细胞变圆，细胞黏附性增强，胞内颗粒增多，且流式鉴定巨噬细胞表面标记CD86为阴性。 3.BMSCs使M1型巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α、iNOS、CCL2、-CD86mRNA水平明显减少，Arg1、CD206、IL-10 mRNA水平明显增加，且上清液中IL-6和TNF-α含量明显减少，CD206明显增加。 4.BMSCs使M2型巨噬细胞分泌的Arg1、CD206、FIZZ-1、Ym-1、IL-10mRNA水平明显增加，CD206明显增加。 结论： BMSCs不仅抑制M1型巨噬细胞活性，还能诱导M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，使M2型巨噬细胞功能进一步活化，抗炎因子生成增多，促炎因子生成减少，由组织促炎反应向抗炎反应调节，进而改善失控性炎症反应。 意义: 本实验证实了我们的设想:MSCs对巨噬细胞极化有影响，不仅对未极化巨噬细胞有影响，而且对已经极化的巨噬细胞（M1/M2型巨噬细胞）有影响，通过影响巨噬细胞的极化而抑制炎症因子的表达水平、增加抗炎因子的表达水平，从而减轻组织的炎症反应，保护脏器功能。本实验为研究BMSCs对脓毒症等炎症相关疾病的治疗在细胞水平上提供了理论支持。
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