摘要
目的：白细胞介素6（IL-6）是一类重要的促肿瘤细胞因子，其通过自分泌在肾细胞癌（RCC）的发生和发展中起重要作用。肝细胞粘附分子（hepaCAM）属于抑癌蛋白，其在RCC发生早期因受各种因素影响出现下调或完全缺失。本项目研究中，将探讨IL-6与hepaCAM在RCC发生发展中的相互关系及作用机制。 方法： 1）收集74例RCC肿瘤组织和43例癌旁组织，免疫组化检测其IL-6和hepaCAM的蛋白表达水平。统计分析IL-6和hepaCAM在RCC肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异，分析RCC肿瘤组织中IL-6和hepaCAM表达相关性，分析RCC肿瘤组织中IL-6、hepaCAM两者与临床病理参数之间的相关性。 2）收集30位RCC患者的肿瘤组织、癌旁组织和血清标本，收集13位健康志愿者的血清标本，ELISA检测患者和健康志愿者的血清中IL-6的水平，Q-PCR和 Western blot检测肿瘤组织和癌旁组织中hepaCAM的mRNA水平和蛋白水平。统计分析RCC患者和健康志愿者的血清IL-6水平差异，分析30例配对RCC肿瘤组织和癌旁组织hepaCAM的蛋白及mRNA表达差异，分析患者血清IL-6水平与RCC肿瘤组织中hepaCAM蛋白及mRNA表达之间的相关性。 3）培养人RCC细胞株786-O、769-P、A498、ACHN和Caki-1，培养人永生化肾小管上皮细胞株HK-2。 a）ELISA检测五种 RCC细胞株培养上清液IL-6的水平，Q-PCR及western blot检测RCC细胞株和HK-2的hepaCAM mRNA和蛋白水平。 b）外源性IL-6不同浓度（0、10、20、40ng/ml）和不同作用时间（0、6、12、24、48小时）处理769-P和Caki-1后，Q-PCR及western blot检测其hepaCAM的mRNA和蛋白水平。 c）siRNA-IL-6转染细胞后，q-PCR及western blot检测细胞hepaCAM的mRNA和蛋白水平。 d）hepaCAM过表达腺病毒转染ACHN和769-P后，ELISA检测上清液IL-6的水平，western blot检测hepaCAM、IL-6R和gp130蛋白表达水平。 4）培养人RCC细胞株769-P，A498和ACHN。设置空白对照组、空载腺病毒组、IL-6处理组（20ng/ml）、hepaCAM过表达组以及IL-6处理联合hepaCAM过表达组。CCK-8检测各组细胞活性；克隆形成实验检测增殖能力；流式细胞技术细胞周期分布情况；western blot检测增殖相关分子C-myc、PCNA和cyclin D1的蛋白表达情况。 5）培养人RCC细胞株769-P，A498和ACHN。 a) siRNA-IL-6转染细胞，western blot检测下游磷酸化STAT3、ERK和AKT水平。 b）外源性 IL-6（20ng/ml）与不同抑制剂联用（JAK/STAT3抑制剂 stattic[10uM]、MEK/ERK抑制剂 U0126[5uM]和 PI3K/AKT抑制剂MK-2206[1uM]），Western blot分别检测磷酸化及总的STAT3、ERK和AKT表达，检测hepaCAM蛋白表达情况，Q-PCR检测hepaCAM mRNA表达情况。 c）外源性IL-6（20ng/ml）与stattic（10uM）或/和hepaCAM过表达腺病毒联合处理，CCK-8检测各组细胞活性。 d）siRNA-IL-6、外源性IL-6（20ng/ml）或stattic（10uM）单独处理或联合处理细胞，Western blot检测DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达情况。 e）外源性IL-6（20ng/ml）分别于与DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza（10uM）、siRNA-DNMT1或siRNA-DNMT3联合处理细胞，Western blot检测DNMT1、DNMT3b和hepaCAM蛋白表达，Q-PCR和甲基化特异性PCR检测hepaCAM mRNA表达和启动子甲基化水平 结果： 1）IL-6的蛋白表达在肿瘤组织中明显高于癌旁组织（P＜0.001），hepaCAM的蛋白表达在肿瘤组织中明显低于癌旁组织（P＜0.001）。在RCC肿瘤组织中，IL-6的高表达与hepaCAM的低表达具有显著一致性（kappa=0.748,P＜0.001）。RCC组织中IL-6的表达与患者肿瘤分期存在正相关性（P=0.019），hepaCAM与所分析的各项临床病理参数之间无显著相关性。 2）RCC患者血清IL-6水平显著高于健康志愿者（P=0.019），且患者血清IL-6水平与患者肿瘤分期存在正相关性（P=0.035）。HepaCAM的mRNA表达在肿瘤组织中明显低于癌旁组织（P＜0.001），western blot所检测的hepaCAM蛋白表达在肿瘤组织中低于癌旁组织。患者血清IL-6水平与hepaCAM mRNA和蛋白表达均无显著相关性。（mRNA:R=-0.1985，P=0.2931；蛋白：R=-0.2050，P=0.2772）。 3）RCC细胞株中786-O、ACHN和A498的hepaCAM蛋白表达缺失，Caki-1和769-P低表达，而正常人肾小管上皮细胞株HK-2的hepaCAM高表达。外源性IL-6处理后，769-P和Caki-1中hepaCAM mRNA水平呈浓度和时间依耐性下调，769-P蛋白水平呈浓度和时间依耐性下调。沉默细胞IL-6表达后，769-P、A498、ACHN和Caki-1中hepaCAM mRNA和蛋白水平均上调。腺病毒转染使hepaCAM在细胞过表达后，769-P、ACHN的IL-6R和gp130蛋白表达未改变，细胞上清IL-6水平未改变。 4）RCC细胞株ACHN、769-P和A498中，hepaCAM过表达能显著下调三株细胞的细胞活性、增殖能力，阻滞细胞于G1期，并下调C-myc、PCNA和cyclin D1的蛋白水平。外源性IL-6与之相反能上调三株细胞的细胞活性和增殖能力，使S期细胞增多，上调C-myc、PCNA和cyclin D1的蛋白水平上调。HepaCAM转染与IL-6联合处理时，与对照组相比三株细胞活性、增殖能力均下调，细胞阻滞于G1期，增殖相关蛋白水平下调。提示hepaCAM能显著对抗IL-6促RCC细胞增殖的效应。 5）沉默RCC的IL-6表达后，ACHN、769-P和A498中磷酸化的STAT3、ERK和AKT水平均下降（A498的ERK磷酸化水平除外），加入外源性IL-6后，三种细胞中磷酸化的STAT3、ERK和AKT水平均上调。三条通路不同抑制剂处理后，仅JAK/STAT3抑制剂stattic能使hepaCAM的mRNA水平和蛋白水平明显上调，并能显著抵消IL-6对hepaCAM表达的抑制效应。提示IL-6通过STAT3通路调节 hepaCAM。IL-6/STAT3通路对hepaCAM的调节是通过DNMTs进行的，但在不同RCC细胞中机制尚不完全一样：在ACHN和769-P中，IL-6通过DNMT1诱导hepaCAM启动子异常高甲基化从而引起hepaCAM表达抑制；在A498中，IL-6通过DNMT3b诱导hepaCAM启动子高甲基化和表达抑制，同时也通过上调DNMT1来抑制hepaCAM表达，但此效应不涉及DNMT1的DNA甲基化修饰活性。 结论：在RCC中，IL-6能通过STAT3通路上调DNMT1和DNMT3b表达，从而引起hepaCAM启动子区域异常高甲基化状态和hepaCAM表达抑制，最终促进RCC增殖。
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