摘要
第一部分：黄芪对高胰岛素血症致早期2型糖尿病患者肾损伤的影响 目的：评价黄芪（astragalus）对高胰岛素血症（hyperinsulinemia，HINS）致早期2型糖尿病患者肾损伤的影响。 方法：早期2型糖尿病患者68例，采用多次皮下注射胰岛素（Multiple subcutaneous insulin injection，MDI)的方式，给予强化血糖治疗。强化治疗的标准为空腹血糖（FPG）<7.0 mmoL/L，餐后两小时血糖（2 hPG）<10.0 mmoL/L。所有患者血糖达标后，继续强化治疗3周，查患者空腹胰岛素（fasting insulin, FINS）水平≥15mU/L，即符合高胰岛素血症的诊断。将这些达到诊断标准的患者随机分成两组，即黄芪颗粒组（AG组）和高胰岛素血症组（HINS组），每组20例，于分组后次日清晨（黄芪颗粒干预前，T0时间点）抽血检查空腹血糖(FPG)、餐后两小时血糖（2hPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、血肌酐（CREA）、血尿素氮（BUN）、视黄醇结合蛋白（RBP）、胱抑素C（Cys-C）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）。留晨尿检测尿微量白蛋白（Ualb）。AG组患者在每天胰岛素强化治疗的基础上，服用黄芪颗粒，用法是每次4g，每天两次；HINS组患者继续进行胰岛素强化治疗，不加任何其他药物。两组患者均继续强化治疗9周。未达到高胰岛素血症诊断标准的28例患者可以自行选择继续治疗的方式，不再列入实验对象进行干预。AG组和HINS组于强化治疗结束后（黄芪颗粒干预后，T1时间点）抽血复查T0时间点的所有指标。 结果：在T1时间点，与HINS组比较，AG组RBP、Cys-C、Ualb、MDA值均小于HINS组，而GSH-PX、SOD值均大于HINS组，具有统计学意义（P<0.05）。两组患者的FPG、2hPG在各自的组内，从T0到T1，有升高趋势，而HbA1c有下降趋势（P<0.05）；在HINS组内，从T0到T1，RBP、Cys-C、Ualb、MDA有升高趋势，而GSH-PX、SOD有下降趋势（P<0.05）。 结论：对早期2型糖尿病患者使用胰岛素进行强化治疗，血糖达标后，继续治疗超过3周，患者可以出现高胰岛素血症，这种高胰岛素血症持续9周以上，可以对肾脏有轻微的损伤作用，具体表现在可以使得RBP、Cys-C、Ualb等指标升高；也使得体内氧化应激水平增高，具体表现在MDA升高，GSH-PX、SOD降低。黄芪颗粒能够阻止高胰岛素血症下的RBP、Cys-C、Ualb水平的升高，还能够阻止高胰岛素血症下体内的氧化应激的增强，对肾脏有保护作用。 第二部分：黄芪甲苷对高胰岛素血症致实验性糖尿病大鼠肾损伤的影响及机制研究 目的：在建立的高胰岛素血症的糖尿病大鼠模型上，研究AS-Ⅳ对高胰岛素血症诱导的肾脏损伤的影响，分析AS-Ⅳ保护肾脏作用的可能机制。 方法：成功建立实验性糖尿病大鼠模型（腹腔注射STZ55 mg/kg)，一周以后，采用皮下注射地特胰岛素（6U/day）的方式控制血糖，一直持续4周。4周后测量大鼠清晨的胰岛素水平，当INS>30μU/ml,认为高胰岛素血症大鼠模型成功建立。符合高胰岛素血症诊断的大鼠随机被分成5组，即高胰岛素血症组（HINS）、AS-Ⅳ（2.5、5和10 mg/kg/day，ig）组和Tempol（60mg/kg/day, ig）组；正常组（Control）作为空白对照。除了正常组外，所有的高胰岛素血症大鼠继续维持胰岛素治疗12周。血糖每隔1、2或4周测量一次，在第12周周末，检测HbA1c、血清INS、CREA、BUN、ALT、AST、TG和TC。采用代谢笼法，在第4周、8周、12周周末收集24h尿液，测量24h尿白蛋白排泄率。检测肾脏上极组织的MDA、GSH-Px、SOD、IL-1β、TNF-α和COl-Ⅳ。使用HE、PAS染色观察常规肾脏病理切片；使用透射电镜观察肾小球超微结构。使用Western blot的方法，检测Nox4、pERK1/2和TRPC6的蛋白表达。 结果： 1.与正常组比较，HINS组大鼠尿蛋白排泄率较高，有统计学意义（P<0.05）。AS-Ⅳ可以在一定程度上减轻白蛋白尿的症状。 2.与正常组比较，HINS组MDA水平增加，GSH-Px和SOD水平降低，有统计学意义（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明显减少MDA，增加GSH-Px和SOD。 3.与正常组比较，HINS组IL-1β和TNF-α水平增加，有统计学意义（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明显减少IL-1β和TNF-α。 4.与正常组比较，HINS组 Col-Ⅳ和 LN水平增加，有统计学意义（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明显减少Col-Ⅳ和LN。 5.与正常组比较，HINS组出现轻度的肾小球系膜细胞增生，AS-Ⅳ可以阻止肾小球系膜细胞的增生。 6.与正常组比较，HINS组肾小球基底膜增厚，足突细胞有少量融合，AS-Ⅳ可以阻止肾小球基底膜增厚以及足突细胞融合。 7.与正常组比较，HINS组Nox4蛋白，pERK1/2蛋白水平增加，TRPC6蛋白水平降低，有统计学意义（P<0.01）。AS-Ⅳ可以明显抑制Nox4和pERK1/2蛋白的表达，而增加TRPC6蛋白的表达。 结论： 1. STZ诱导的糖尿病大鼠经过胰岛素强化治疗4周，可以出现高胰岛素血症，这种状态持续12周可以对肾脏造成损伤。 2. AS-Ⅳ对高胰岛素血症对大鼠肾脏的损伤具有保护作用，其可能与抑制氧化应激、促炎症因子生成，下调Nox4和pERK1/2蛋白的表达，增加TRPC6蛋白的表达有关。 第三部分：高胰岛素致人肾小球系膜细胞损伤的机制研究及黄芪甲苷的干预作用 目的： 研究NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路在高胰岛素致MCs损伤中的作用，探讨黄芪甲苷对此通路的干预调控及对高胰岛素致MCs损伤的影响。 方法： 1.将常规培养的MCs细胞分为以下6组：NG（5.6 mM葡萄糖）组，胰岛素（12.5、25、50、100、200 nM）组。将MCs分别孵育12h、24h、36h、48h、72h后，使用MTT的方法，检测各组细胞的增殖情况。 2.将常规培养的MCs分为以下5组：（1）NG，（2）HINS（100nM）12h，（3） HINS（100nM）24h，（4）HINS（100nM）36h，（5）HINS（100nM）48h。采用实时荧光定量PCR法检测Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表达；采用Western blot法检测Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表达。 3.将常规培养的MCs分为以下6组：（1）NG，（2）HINS（100nM）0.5h，（3） HINS（100nM）1h，（4）HINS（100nM）3h，（5）HINS（100nM）24h，（6） HINS（100nM）48h。分别给予高胰岛素培养至相应时间，HINS分别刺激0.5h、1h、3h、24h、48h，采用Western blot法检测相应时间MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化水平。 4.将常规培养的MCs细胞分为以下7组：（1）NG组，（2）NG+DPI（10μM）组，（3）NG+Tempol（100μM）组，（4）HINS（100nM）组，（5）HINS（100nM）+DPI（10μM）组，（6）HINS（100nM）+Tempol（100μM）组，（7）HINS（100nM）+U0126（10μM）组。分别给药48h后，采用MTT法对各组细胞的增殖情况进行检测。 5.将常规培养的MCs细胞分为以下8组：（1）NG组，（2）NG+DPI（10μM）组，（3）NG+Tempol（100μM）组，（4）NG+U0126（10μM）组，（5）HINS（100nM）组，（6）HINS（100nM）+Tempol（100μM）组，（7）HINS（100nM）+DPI（10μM）组，（8）HINS（100nM）+U0126（10μM）组。分别给药48h后，采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞的ROS水平。 6.将常规培养的MCs分为以下5组：（1）NG组，（2）HINS（100nM）组，（3） HINS（100nM）+U012610μM组，（4）HINS（100nM）+DPI10μM组，（5） HINS（100nM）+Tempol100μM组。分别给药48h后，采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性，采用Western blot法检测各组细胞的Nox4蛋白、TRPC6蛋白的表达情况以及ERK1/2蛋白的磷酸化水平。 7.将常规培养的MCs细胞分为以下5组：（1）NG组，（2）HINS(100nM)组，（3）HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM组，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM组，（5）HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM组。48h后，采用MTT法分别检测各组细胞的增殖情况。 8.将常规培养的MCs分为以下6组：（1）NG组，（2）HINS(100nM)组，（3）HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM组，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM组，（5）HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM组，（6）HINS(100nM)+Tempol100μM组，分别给药48h后，采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞ROS水平。 9.将常规培养的MCs分为以下6组：（1）NG组，（2）HINS(100nM)组，（3）HINS(100nM)+ AS-Ⅳ25μM组，（4）HINS(100nM)+ AS-Ⅳ50μM组，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM组，（6）HINS(100nM)+OAG100μM组。给药48h后，采用实时荧光定量PCR法进行检测各组细胞的TRPC6 mRNA的表达水平，采用Western blot法进行检测各组细胞的TRPC6蛋白的表达水平。 10.将常规培养的 MCs分为以下6组：（1）NG组，（2）HINS(100nM)组，（3） HINS(100nM)+ AS-Ⅳ25μM组，（4）HINS(100nM)+ AS-Ⅳ50μM组，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM组，（6）HINS(100nM)+DPI10μM组。分别给药48h后，采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性，采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞的Nox4 mRNA的表达水平，采用Western blot法检测各组细胞的Nox4蛋白的表达水平。 11.将常规培养的 MCs分为以下6组：（1）NG组，（2）HINS(100nM)组，（3） HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM组，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM组，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM组，（6）HINS(100nM)+U012610μM组。给药48h后，采用Western blot法检测各组细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平。 结果： 1.高浓度胰岛素培养一定时间后，MCs的增殖显著升高，并可促进ROS的生成。高胰岛素促进系膜细胞增殖的作用能够被NADPH氧化酶抑制剂、ROS抑制剂和ERK通路抑制剂抑制。 2.高浓度胰岛素培养一定时间后，MCs中Nox4 mRNA及蛋白表达水平显著上调。使用特异性信号分子抑制剂后，高胰岛素环境下MCs内Nox4蛋白和ROS的生成均显著降低，提示高胰岛素促系膜细胞增殖作用可能是通过上调 Nox4亚基的表达，从而促进ROS生成来实现的。 3.高浓度胰岛素培养一定时间后，MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化水平显著上调，激活ERK信号通路。NADPH氧化酶抑制剂和ROS抑制剂均能显著抑制高胰岛素环境下MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化，提示高胰岛素对MCs中ERK信号通路的调控作用与NADPH氧化酶性ROS具有密切的相关性。ERK通路被抑制时，对高胰岛素环境下MCs中Nox4蛋白表达水平以及ROS水平均没有明显影响，仅能抑制细胞异常增殖。提示在上述信号通路中 ERK1/2活化处于NADPH氧化酶性ROS通路的下游。 4.高浓度胰岛素培养一定时间后，MCs中TRPC6 mRNA和蛋白表达水平显著下调。当Nox4或pERK1/2表达被抑制时，高胰岛素下调的TRPC6蛋白表达水平显著升高；此外当采用NADPH氧化酶抑制剂、ROS抑制剂、ERK通路抑制剂时均能显著增强高胰岛素环境下MCs中TRPC6蛋白的表达，提示高胰岛素可能是通过激活NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路来发挥对MCs中TRPC6蛋白表达的抑制作用。 5. AS-Ⅳ可以抑制高胰岛素诱导的 MCs异常增殖、Nox4亚基的表达上调、ROS生成、ERK1/2蛋白磷酸化以及TRPC6蛋白表达下调，从而发挥对系膜细胞中高胰岛素环境下的NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路的抑制作用。 结论： 1.高浓度胰岛素可以诱导MCs的异常增殖，并显著抑制系膜细胞TRPC6蛋白的表达。高胰岛素诱导系膜细胞损伤的作用可能是通过调节 NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路来实现的，在该信号通路中，NADPH氧化酶性ROS生成可能是存在于ERK信号通路的上游。 2. AS-Ⅳ对高胰岛素诱导的MCs异常增殖以及TRPC6蛋白下调减少具有有效的抑制作用。黄芪甲苷可能是通过抑制NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路来发挥其保护作用。
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