摘要
糖皮质激素由于其在免疫应答、抗毒、抗炎等方面的优异表现，在临床上常用于治疗炎性及自身免疫性疾病。但是，长期大剂量使用会导致一系列并发症。其引起的激素性骨质疏松是一种常见的骨科疾病，目前已认识到糖皮质激素对成骨细胞的抑制作用是引起激素性骨质疏松的主要原因。然而，作为人体一种正常分泌的激素，糖皮质激素对人体的正常生长发育和新陈代谢又是必不可少的，同时，对骨骼的正常生理活动具有重要的调节作用。研究表明，在人体正常生理活动中，糖皮质激素可以促进骨髓基质干细胞向成骨细胞方法分化，促进成骨细胞成熟，进而增加人体的成骨活动。在体外实验中也发现低浓度的糖皮质激素在一定条件下对于小鼠来源的成骨细胞有一定的促进增殖的作用，同时还有研究发现，糖皮质激素可以抑制外周血单核细胞引起的成骨细胞凋亡。然而，对于糖皮质激素引起这两种截然相反结果的原因，目前还没有详细的研究。 自噬是真核细胞中高度保守的一种细胞生物学功能，它参与清除降解的蛋白，受损、过量的细胞器及细胞内病原体。自噬存在几乎所有的细胞中以维持细胞的正常代谢。但是作为一种细胞保护机制，自噬活性在饥饿、应激、感染等状态下会大大增加，以抵抗外界的不利因素，从而维持细胞的正常生命活动。然而自噬在糖皮质激素调控成骨细胞过程中的作用目前还存在争议。一些研究认为糖皮质激素诱导的自噬可以促进成骨细胞凋亡，但是也有研究认为适当的自噬可以保护细胞，避免凋亡。综上所述，自噬与成骨细胞、糖皮质激素之间的相互关系复杂，研究它们之间的相互关系，对于进一步了解糖皮质激素在成骨细胞调控中的作用及进一步了解激素性骨质疏松的发病机制具有重要意义。 目的: 本论文的主要目的是研究在糖皮质激素调节成骨细胞增殖过程中自噬是否参与并发挥作用，以及自噬过程中存在的分子机制，为临床上合理使用糖皮质激素及治疗和预防激素性骨质疏松提供新的理论依据和新的思路。 方法: 本课题采用有较强增殖能力的人成骨细胞系hFOB1.19细胞作为研究对象。 1、以梯度浓度地塞米松(0M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M)分别作用hFOB1.19细胞0h、24h、48h、72h，然后分别以MTT法、EdU染色法、Annxin-ⅤFITC/PI双染流式细胞仪检测药物作用后的细胞增殖及凋亡情况。 2、为了研究自噬是否参与地塞米松调节成骨细胞增殖的过程，根据第一步的实验结果，将地塞米松(10-8M)和3-MA（5mM）、地塞米松(10-6M)和Rap（3μM）组合后共同作用于成骨细胞，然后仍然以MTT法、EdU染色法、Annxin-ⅤFITC/PI双染流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡情况，将检测结果和单独使用地塞米松的细胞进行比较。 3、为进一步研究地塞米松对于hFOB1.19细胞自噬的调节作用，以浓度为10-8M的地塞米松作用于成骨细胞，然后在加入药物后的第0h、1h、3h、6h、12h、24h收集细胞，采用Western-blot法检测自噬相关蛋白beclin1、LC3的表达变化情况。同样，以浓度为10-6M的地塞米松作用于细胞，然后在加入药物后的第0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h收集细胞，采用Western-blot法检测自噬相关蛋白LC3和beclin1的表达变化情况。根据上述实验结果，分别以0M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M的地塞米松分别作用成骨细胞6h，然后采用Western-blot法检测自噬相关蛋白LC3和beclin1的表达变化情况。最后，将地塞米松(10-8M)和3-MA(5mM)、地塞米松(10-6M)和Rap（3μM）共同作用于成骨细胞，Western-blot法检测自噬相关蛋白beclin1、LC3的表达变化情况，将结果同单独使用地塞米松的分组进行比较。 4、将细胞分为对照组、地塞米松组(10-8M)，地塞米松+3-MA(5mM)，药物孵育6小时后，分别以透射电镜技术和免疫荧光技术观察细胞内自噬小体的数量。 5、以不同浓度的地塞米松（0M、10-4M、10-6M、10-8M）作用于细胞6小时，分别用流式细胞术和荧光显微镜技术检测细胞内ROS表达水平，检验细胞内ROS水平与地塞米松的关系。 6、为研究ROS在地塞米松诱导成骨细胞自噬中的作用，用浓度为10-8M的地塞米松和ROS清除剂catalase(500U/ml)共同作用于hFOB1.19细胞6小时，另外一组只用地塞米松，然后以western blot法检测自噬相关蛋白LC3、beclin1。同时，为研究ROS对SIRT1/FOXO3A信号通路的作用，采用western blot法检测SIRT1和FOXO3A蛋白在hFOB1.19细胞中的表达变化情况。 7、为研究SIRT1/FOXO3A信号通路在地塞米松诱导成骨细胞自噬中的作用，用浓度为10-8M的地塞米松与SIRT1抑制剂sirtinol(5μM)共同作用于hFOB1.19细胞6小时，然后以western blot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1的变化。 8、为了进一步验证ROS/SIRT1/FOXO3A信号通路在低浓度地塞米松调节成骨细胞活增殖中的作用，用浓度为10-8M的地塞米松作用于hFOB1.19细胞，同时分别给予catalase(500U/ml)、sirtinol(5μM)、3-MA(5mM)共培养，6小时后，以MTT法和EdU染色法检测各组细胞增殖活性。 结果: 1、地塞米松对成骨细胞的调节作用具有两面性，低浓度地塞米松可以在短时间内轻度地促进细胞增殖、降低细胞凋亡率，高浓度的地塞米松则持续地抑制细胞增殖、增加细胞凋亡率。 2、使用3-MA可以阻断低浓度地塞米松对成骨细胞增殖能力的促进作用，使细胞凋亡率上升;而Rap可改善地塞米松对成骨细胞活性的抑制作用，降低凋亡率。 3、地塞米松可以增加成骨细胞中LC3及beclin1的表达量，并且具有时间依赖和浓度依赖的特点。高浓度地塞米松(10-6M)在作用的第1小时即可使LC3及beclin1的表达量达到较高的水平，此后逐渐下降，而在低浓度地塞米松(10-8M)组，LC3及beclin1的表达量逐渐上升，在第6小时达到最高水平，然后逐渐下降。在第6小时观察不同浓度地塞米松对自噬水平的影响可以发现，10-8M地塞米松引起的LC3和beclin1水平上升最明显，不管是随着地塞米松浓度的逐渐升高还是逐渐降低，LC3和beclin1的表达量都呈逐渐降低的趋势。加入自噬抑制剂3-MA后，低浓度地塞米松(10-8M)对自噬的促进作用被抑制，而加入自噬激动剂Rap后，则明显提高了自噬的强度。 4、地塞米松可以显著增加细胞内自噬小体的数量，增加细胞内LC3点簇状聚集的数量，地塞米松这种增加细胞内自噬小体数量的作用可以被3-MA阻断。 5、与对照组相比，地塞米松可以上调细胞内ROS的含量，地塞米松浓度越高，其上调ROS含量的能力越强。 6、加入ROS清除剂catalase后，自噬相关蛋白LC3和beclin1的表达量与单独使用地塞米松组相比明显降低。同时，catalase还可以使SIRT1和FOXO3A蛋白表达量明显下降。 7、SIRT1抑制剂sirtinol可以降低自噬相关蛋白LC3和beclin1的表达量。 8、与单独使用地塞米松相比，catalase和sirtinol都显著降低了成骨细胞的增殖率，其作用效果与3-MA相似。 结论: 1、地塞米松对成骨细胞增殖能力的调节具有两面性，低浓度地塞米松可以在短时间内轻度地促进成骨细胞增殖，而高浓度地塞米松则可持续促进成骨细胞凋亡，抑制细胞增殖。自噬参与地塞米松调节成骨细胞增殖的过程。 2、地塞米松能够以时间依赖和浓度依赖的方式调节成骨细胞自噬，增加细胞内自噬小体的数量。 3、ROS/SIRT1/FOXO3A通路参与地塞米松诱导成骨细胞自噬的过程。
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