摘要
醋酸菌在食醋工业化生产过程中的广泛应用得益于其突出的高产酸、耐酸性能，而以吡咯喹啉醌(PQQ)为辅酶的乙醇脱氢酶(PQQ-ADH)在此过程中扮演着重要角色，因其能将乙醇氧化生成乙醛，进而在乙醛脱氢酶的作用下转化成乙酸。本文以从浙江传统玫瑰醋中分离得到的巴氏醋杆菌Ab3为出发菌株，借助Tat表达体系并融合抗性基因对其乙醇脱氢酶大亚基(AdhA)进行可溶性表达的探索和定向进化筛选，为周质蛋白基因的可溶性表达及功能筛选提供了方法论。基于生物信息学分分析方法，本文首先对不同醋酸菌中的AdhA进行比对分析，包括信号肽预测，二级结构、三级结构的预测与分析等，阐述了不同醋酸菌中AdhA在序列上以及结构上的区别，同时指出可能且容易发生突变的影响AdhA活性的位点。在此基础上构建AdhA的Tat-bla表达体系，结合易错PCR的方法对巴氏醋杆菌AdhA进行了定向进化。 生物信息学结果表明，不同醋酸菌的AdhA上均存在一段含有双精氨酸基序S-R-R-x-F-L-K的独特信号肽，能够被细菌Tat表达系统识别，从而实现跨膜转运。通过AdhA的氨基酸序列的比对及每个氨基酸位点的剖析可知，在巴氏醋杆菌Ab3的AdhA的氨基酸序列中，与高产酸、耐酸的Komagataeibacter相比较，Ala30Thr、Val31Met、Pro32Ala、Ala33Ser、Asp36Asp、Glu43Glu、Glu53Gly、Lys262Gln、Pro266Pro、Lys267Thr、Ser289Ala、Ile311Lys、Gln393Val、Leu402Lys、Lys457Thr、Glu508Ala、Thr509Glu、Val510Ala、Trp511Trp、Gly559Gly、Asp639Asp、Met662Val、Thr697Gly、Asn731Gly这些位点的改变可能会引起其二级结构的改变，预示着ADH的活性与这些位点有关，并进而影响醋酸菌的耐酸性。 在生物信息学分析的基础上，成功克隆了adhA基因及氨苄抗性基因，构建了重组质粒pADH-Bla，实现了adhA基因在大肠杆菌周质空间的可溶性表达和定向进化。利用大肠杆菌Tat表达系统的独特优势，选用易错PCR的方法对adhA基因定向进化，抗性平板筛选出氨苄抗性能力提高的突变菌株M14，M21，M28，M44，M59和M60。M14与M21的adhA基因有3个突变位点A158G，C290G，A784C，对应的氨基酸突变为Glu53Gly，Ala97Gly，Lys262Gln。M28与M60的adhA基因的突变位点为A158G，C1204G，对应的氨基酸突变为Glu53Gly，Leu402Lys。其中M14和M28有共同的突变位点A158G。M44的adhA基因共有5个突变位点，分别为A129G，G643T，A1523C，C1677A和A1984G，对应的氨基酸突变为Glu43Glu，Ala215S er，Glu508Ala，Gly559Gly和Met662Val。M59的adhA基因的突变位点为T473A，T1529C，对应的氨基酸突变为Phe158Tyr，Val510Ala。 本课题的开展揭示了部分对乙醇脱氢酶活性影响的位点，这为进一步定向改造ADH，提高ADH的活性提供了理论依据。同时Tat体系的成功开发也为研究醋酸菌中其它关键酶提供了基础。
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