摘要
土传病害严重影响农业经济发展，同时化学肥料的过量使用也导致了环境污染、病菌抗逆性等一系列的产生。生物防治作为一种环境友好型的土传病害处理方式被广泛关注，从而使得功能性生物有机肥的研究成为众多研究者的研究热点。脂肽类表面活性剂中，surfactin具有显著的生物学性质，故而被作为一种功能性物质添加至生物有机肥中来进行生物防治土传病害的研究，并且具有了明显的效果;同时，聚谷氨酸作为一种生物有机肥添加剂，已经应用于作物生长中，并且具有明显的增产增质作用。 本文中，枯草芽孢杆菌-NJtech489具有生产surfactin和聚谷氨酸两种功能性物质的能力，因此能够利用枯草芽孢杆菌-NJtech489实现两者的联产，从而产生既具有肥效又具有生防功能的多元有机肥，具有显著的应用优势。然而生产菌株在对两种功能性物质的生产能力，以及二者在生物防治中的影响关系等对于实现多功能有机肥的现实应用是值得探索的问题。 因此，本文主要的研究内容及其成果如下所示: (1)枯草芽孢杆菌-NJtech489共发酵生产surfactin和聚谷氨酸的培养基优化。首先通过单因素实验确定共发酵条件（温度、发酵时间、金属镁、铁、锰、钙离子）对两种产物的有明显影响，并确定六个条件分别为:温度37℃、发酵时间36 h、七水合硫酸亚铁0.02g/L、七水合硫酸镁0.2 g/L、锰离子和钙离子不添加。得到另外六组影响因素的最佳范围，分别为(g/L):接种量2-6％(v/v);甘油量20-40;硫酸铵添加量3-10;谷氨酸钠添加量25-45;氯化钠4-8;磷酸二氢钾添加量1-6。最后通过可视化优化分析得到最佳配方为:接种量3.69％、甘油31.56 g/L、硫酸铵8.44 g/L、谷氨酸钠29.89 g/L、氯化钠5.61 g/L、磷酸二氢钾1.37 g/L。综上条件下，枯草芽孢杆菌-NJtech489发酵生产surfactin和聚谷氨酸的产量分别可达543.21 mg/L和21.74 g/L，比最初产量分别提高了1.1倍和13.5倍。 (2)菌株、surfactin和聚谷氨酸对不同土传病害产生菌株的生物防治效果。通过菌落对峙实验和牛津杯实验得到，枯草芽孢杆菌-NJtech489对植物病原真菌和细菌具有明显的抑菌作用。同时，在研究其抑菌效果的作用机制（竞争作用和抗生素拮抗作用）的主次分析实验中，得出结论:竞争作用是其主要的抗菌机制，抗生素拮抗作用为辅助增强作用机制。Surfactin对真菌具有较强的抑菌效果，而对细菌抑菌效果不明显，并且其抑菌效果与浓度成正比，对所研究的五株真菌病害菌的最低抑制浓度分别为:RSF(Rhizoctonia solani)＜100 mg/L、GZ(Gibberellazeae)＜100 mg/L、PC(Phytophthora capsici)200 mg/L、FOV(Fusarium oxyporum f sp.vasinfectum)300 mg/L、FON(Fusarium oxyporum f sp.niveum)300 mg/L。γ-PGA对病害菌无抑制效果，也不能促进病原真菌的生长速度;γ-PGA与surfactin同时作用时，二者未发生协同作用。 (3)分离不同surfactin同系物组分并研究其生物活性差异。通过制备色谱对surfactin同系物组分进行分离，得到了制备色谱分离surfactin同系物组分的分离方法，即:色谱柱为SNAP Ultra C18(30g)，采用流动相梯度极性洗脱方式;流速为25 mL/mim检测波长214nm;进样量为1 mL(含surfactin粗提物250 mg);收集方式为10 mL/管。得到C13 surfactin粉末23.6 mg(纯度＞95.00％)、C14(两个同系物)surfactin粉末53.8 mg（纯度＞95.00％），C15 surfactin粉末87.9 mg（纯度≈99.99％），总收率为40.27％。在对surfactin不同同系物组分的临界胶束浓度测定实验表明，surfactin同系物组分的浓度低于CMC值(25 mg/L)时，C15-surfactin溶液的表面张力最低;由抑菌实验表明，不同surfactin同系物组分抑菌活性差异不显著。
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