摘要
研究背景： 随着环境污染加重，人口老龄化加剧，中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）疾病发病率日渐上升，严重危害人类健康。这些CNS疾病的临床治疗都面临一个共同的瓶颈——血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）。BBB主要由内皮细胞间紧密连接（Tight Junction, TJ）构成，对循环血液中的物质具有严格选择透过机制，从而保证 CNS的正常功能。然而 BBB在阻止异物入侵脑组织的同时，也阻止了大部分治疗药物进入脑病变区域。如何安全有效地开放 BBB，一直是研究者关注的焦点。 本实验室前期研究发现，电磁辐射（Electromagnetic Radiation, EMR），尤其是电磁脉冲（Electromagnetic Pulse, EMP），可导致BBB通透性的可逆性增加。但EMP诱导BBB通透性增加的最佳物理参数尚不清楚。此外，其他参数EMR是否也具有该效应？其效应规律如何？亦不清楚。为解决上述问题，本研究以 SD大鼠为实验对象，研究了不同参数EMR，如EMP、超宽谱电磁脉冲（Ultra-Wide Band Electromagnetic Pulse, UWB-EMP）和射频辐射（Radiofrequency Radiation, RFR）对BBB通透性的影响。 研究目的： 探讨不同参数EMR（EMP、UWB-EMP、RFR）对BBB通透性的影响，为EMR开放BBB的临床应用提供初步理论和实验依据。 第一部分 EMP对BBB通透性的影响 材料与方法： 1辐照源：SPG200-EMP辐照源，辐照腔内为均匀的电磁场，场强350kV/m。脉宽可调为50ns或7ns。脉冲次数可设置为0~6000次。重复频率1Hz。 2动物分组及辐照参数：健康成年雄性SD大鼠108只，随机分为辐照组（84只）和假辐照组（24只）。辐照参数具体如下： 2.1不同脉冲次数EMP对BBB通透性影响：场强350kV/m、脉宽50ns，脉冲次数分别为100、200、400、800、1600次，于全身辐照后3h取材。 2.2不同脉宽EMP对BBB通透性影响：场强350kV/m、脉冲次数200次，脉宽分别为7、50ns，于全身辐照后3h取材。 3检测方法：以内源性白蛋白和外源性伊文思蓝（Evans Blue, EB）为血管通透性示踪剂，分别应用免疫组化和EB荧光显微镜观察等方法检测辐照后BBB通透性。 研究结果： 1、不同脉冲次数EMP对BBB通透性的影响：场强为350kV/m、脉宽为50ns时，经脉冲次数为100、200、400、800、1600次EMP辐照后3h，大鼠脑额叶皮层部分微血管周围出现不同程度白蛋白免疫阳性产物（P＜0.05）；其中200次EMP辐照后，周边出现免疫阳性染色的血管数最多、阳性范围最大，100和400次辐照组次之，800和1600次EMP辐照组则与假辐照组相比无统计学差异（P＞0.05）。EB荧光结果与白蛋白免疫组化结果基本一致。说明：200次EMP辐照后，BBB通透性增加最明显；脉冲次数超过400次后，EMP可能未引起明显的通透性增加。 2、不同脉宽 EMP对BBB通透性的影响：场强为350kV/m，脉冲次数为200次时，经脉宽7ns或50ns的EMP辐照后3h，大鼠脑额叶皮层部分微血管周围出现白蛋白免疫阳性产物（P＜0.05），呈散在分布；脉宽为50ns时，白蛋白免疫阳性范围更大。说明随着脉宽的增宽，BBB通透性逐渐增加。EB荧光显色结果则显示，在该辐照条件下，仅脉宽为50ns时，BBB通透性显著增加（P＜0.05）。 第二部分 UWB-EMP对BBB通透性的影响 材料与方法： 1、辐照源：UWB-EMP辐照源，由脉冲发生器和喇叭天线构成。距离喇叭口不同位置处场强不同，据此可选择辐照场强。脉宽不可调，在1ns之内。脉冲次数可根据实验需要设置。重复频率10Hz。 2、动物分组及辐照参数：成年雄性SD大鼠180只，随机分为辐照组（132只）、阳性对照组（12只）和假辐照组（36只）。辐照组具体参数如下： 2.1不同场强UWB-EMP对BBB通透性影响：脉冲次数20000次，场强分为50、200、400kV/m，全身辐照后3h取材； 2.2 UWB-EMP对BBB通透性影响的时效规律：场强400kV/m、脉冲次数20000次，全身辐照，根据辐照后取材时间分为0.5、3、6、24h组。 3、检测方法：以内源性白蛋白、血清S100β蛋白和外源性EB为血管通透性示踪剂，分别采用免疫组化、酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）和 EB荧光显微镜观察法检测辐照后 BBB通透性；采用免疫印迹法（Western Blotting, WB）、免疫荧光染色法分析TJ相关蛋白ZO-1的表达水平和分布。 研究结果： 1、不同场强UWB-EMP对BBB通透性的影响：脉冲次数20000次时，经场强为50、200、400kV/m的 UWB-EMP辐照后3h，大鼠脑额叶皮层出现散在分布的白蛋白免疫阳性染色；场强为400kV/m时，白蛋白渗出最多（P＜0.001），其他组与假辐照组相比无统计学差异。EB荧光结果与白蛋白免疫组化染色结果一致。说明脉冲次数为20000次、场强为400kV/m时，UWB-EMP可显著增加BBB通透性。 2、UWB-EMP对BBB通透性影响的时效规律：场强为400kV/m、脉冲次数为20000次时，UWB-EMP辐照后0.5h，大鼠脑额叶皮层白蛋白渗出开始增多；辐照后3h—6h白蛋白渗出最多（P＜0.05）；辐照后24h组，白蛋白染色结果与假辐照组基本相同（P＞0.05）。EB荧光结果与白蛋白免疫组化染色结果一致。血清S100β蛋白 ELISA检测结果显示，UWB-EMP辐照后6h血清 S100β含量显著增多（P＜0.05）。以上结果说明：UWB-EMP辐照后0.5h，BBB通透性即开始增加，于辐照后3-6h之间达到最大，辐照后24h基本恢复正常。 3、UWB-EMP辐照后，TJ相关蛋白Zonula Occludens1（ZO-1）检测结果：400kV/m、20000次UWB-EMP辐照大鼠后，WB法检测发现，辐照后3h和6h脑额叶皮层ZO-1蛋白水平明显降低（P＜0.05）。免疫荧光染色结果显示，辐照后3h，ZO-1免疫荧光强度减弱，而分布方式依然为连续性分布，各组ZO-1蛋白分布无明显差异（P＞0.05）。以上结果提示UWB-EMP可能通过降低ZO-1的表达暂时、可逆地增加BBB通透性。 第三部分 RFR对BBB通透性的影响 材料与方法： 1、辐照源：RFR辐照源，频率1840MHz，输出功率可调，辐照时间可调。 2、动物分组及辐照参数：健康成年雄性SD大鼠36只，随机分为辐照组（18只）和假辐照组（18只）。辐照参数：频率1840MHz，比吸收率（Specific Absorption Rate, SAR）2W/kg，每天辐照1h，连续辐照7d，辐照结束后即刻取材。 3、检测方法：以内源性白蛋白和外源性硝酸镧为血管通透性示踪剂，分别采用免疫组化和透射电镜法观察辐照后BBB通透性；采用WB分析TJ相关蛋白ZO-1表达水平。 研究结果： 经1840MHz、2W/kg RFR连续辐照7d后，大鼠脑额叶皮层白蛋白免疫阳性染色明显增多。硝酸镧示踪法显示，辐照后大鼠脑皮层部分微血管基底膜处有镧颗粒沉积，周围脑实质内有少量镧颗粒渗入。WB法检测ZO-1表达水平发现，RFR辐照后ZO-1表达水平明显下降（P＜0.001），提示TJ损伤可能是RFR辐照后大鼠BBB通透性改变的原因之一。 研究结论： 1、当场强350kV/m、脉宽50ns、脉冲次数200次时，EMP诱导BBB开放的效应最明显。 2、当场强400kV/m、脉冲次数20000次时，UWB-EMP致BBB开放效应最明显，且为短暂、可逆的开放；UWB-EMP可能通过降低ZO-1表达，诱导BBB通透性改变。 3、经1840MHz、2W/kg的RFR连续辐照7d（1h/d），大鼠额叶皮层BBB通透性明显增加，且ZO-1表达水平的降低可能在该过程中发挥重要作用。 4、本研究发现 EMP诱导 BBB开放的效应没有随脉冲次数的增加而更明显，该规律尚需大量实验验证，其中的机制也需要进一步研究。
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