摘要
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引起的一种以水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征的猪肠道传染性疾病，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。尽管对PEDV致病机制进行了一定的研究，取得了一系列有重要意义的成果，但在病毒的侵染机制及与宿主细胞之间的相互作用机制等方面，研究的较少，是近年来被广泛研究的热点。本研究主要针对HMGB1在PEDV感染中作用机制进行了深入探讨，系统分析了PEDV感染与宿主蛋白HMGB1相互关系的机制。主要研究内容包括: 1.甘草素对PEDV的抗病毒效果 甘草素是一个来源于传统中药甘草的天然产物。通过western blot、荧光定量PCR和噬斑形成试验证明了甘草素具有抑制PEDV感染Vero细胞的效果。此外，探索了甘草素抑制PEDV感染的作用过程，发现甘草素对PEDV的入胞和复制有影响，而对细胞、病毒粒子本身、病毒的组装和释放没有影响。 2.HMGB1在甘草素的抗病毒过程中起着重要的作用 HMGB1是一个细胞中含量非常丰富的核蛋白，能作为一个重要的炎性介质释放到胞外空间调节宿主的炎症反应。我们发现甘草素能降低由PEDV感染引起的促炎性因子(IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α)的升高，且Poly(I∶C)引起促炎性因子的升高且促进了PEDV的感染。甘草素是HMGB1的竞争性抑制剂。通过HMGB1抗体中和试验和siRNA干扰HMGB1表达，发现HMGB1在感染条件下对促炎性因子的升高起着重要的作用。HMGB1可与TLR4和RAGE等受体相结合，因此利用TLR4的抑制剂和RAGE的siRNA处理细胞，发现TLR4抑制剂和siRAGE能降低促炎性因子的升高和病毒的感染，且过表达HMGB1的突变体(PCA-C45S、PCA-C106S、PCA-C45106S)可降低促炎性因子的升高和PEDV的感染。此外，我们还证明了HMGB1与TLR4和RAGE结合后可激活P38MAPK来诱导促炎性因子的升高进而有利于PEDV的感染。总之，甘草素与胞外HMGB1结合后，降低了其与TLR4和RAGE受体的结合，从而降低了P38MAPK的激活，使促炎性因子降低来抑制PEDV的增殖。 3.硫酸类肝素是猪流行性腹泻病毒感染Vero细胞的吸附因子 许多病毒利用硫酸类肝素作为它们的吸附因子。在该研究中，证明了PEDV利用硫酸类肝素吸附Vero细胞。Western blot分析、荧光定量PCR和噬斑形成试验揭示被肝素预处理的病毒，其感染细胞的能力受到抑制;而用肝素预处理细胞，对PEDV的感染没有抑制效应。其次，我们发现肝素酶Ⅰ处理细胞去除硫酸类肝素后，细胞对PEDV的易感性下降。另外，我们证明抑制硫酸类肝素生物合成的氯酸钠处理细胞，能够有效抑制PEDV的感染。我们还检测了不同程度硫酸化的两个肝素类似物对PEDV感染的影响，数据表明N-去硫酸化肝素（不是N-乙酰化O-去硫酸化肝素）预处理病毒能够降低病毒感染细胞的能力。此外，肝素可抑制PEDV的复制和HMGB1mRNA水平。总之，研究表明硫酸类肝素是PEDV感染Vero细胞的吸附因子。 4.PEDV N蛋白通过与C/EBP-β相互作用来正调HMGB1的转录及乙酰化和释放 HMGB1是一个重要的促炎性介质并且促进多种炎性疾病的发生。发现了PEDV感染导致HMGB1的乙酰化和释放，PEDV的感染和PEDV衣壳蛋白通过SIRT1、组蛋白乙酰转移酶和NF-κB调节HMGB1的乙酰化。过表达PEDV N蛋白能促进HMGB1的乙酰化和释放。CHIP试验表明PEDV N能与HMGB1启动子区DNA相互作用。双荧光素酶报告基因试验证明了PEDV N蛋白介导的HMGB1的转录与转录因子C/EBP结合基序有关。用Co-IP试验进一步表明病毒的衣壳蛋白与C/EBP-β相互作用来正调HMGB1基因的转录。总之，PEDV感染能引起HMGB1的乙酰化和释放，且主要是PEDVN蛋白起作用。我们的结果对PEDV的发病提供了新的视角并且为发展以HMGB1为靶点的治疗方法和药物提供了理论基础。 5.猪流行性腹泻病毒通过DNA损伤引起HMGB1的释放 由DNA病毒激活的DNA损伤反应被广泛的研究。然而，RNA病毒引起DNA损伤反应的研究很少。因此通过western blot和间接免疫荧光揭示了PEDV快速激活H2AX的磷酸化，且HY增加了PEDVN蛋白的表达。此外，通过western blot、qRT-PCR和噬斑形成试验证明DNA-PK抑制剂(NU7441)和ATM抑制剂（KU-55933）抑制了HMGB1的释放和PEDV的感染，且DNA-PK的抑制剂效果更好。但是ATR的抑制剂（VE-821）对PEDV感染没有影响。此外，PEDV引起PARP1的激活，PARP1的抑制剂3-AB抑制了HMGB1的释放及PEDV的感染。DNA-PK抑制剂(NU7441)和ATM抑制剂(KU-55933)抑制了PARP1的活性，表明PEDV主要通过诱导DNA-PK依赖的DNA损伤和部分ATM依赖的DNA损伤激活PARP1和PEDV的增殖。通过流式细胞术证明了PEDV引起ROS的升高，且抑制DNA损伤和PARP1的激活能降低ROS。总之， PEDV通过DNA损伤/PARP1/ROS引起HMGB1的释放从而有利于自身的复制。
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